Масс-спектрометрия основана на прямом измерении отношения массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z),полученных из анализируемого вещества и находящихся в газовой фазе. Данное отношение выражается в атомных единицах массы (1 а.е.м. = одной двенадцатой массы нуклида 12С) или в дальтонах (1 Да = массе атома водорода).
Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются и перед попаданием в детектор разделяются с помощью масс-анализатора. Все эти действия происходят в камере, в которой насосная система поддерживает вакуум от 10-3 до 10-6 Па.
Результирующий масс-спектр является графиком зависимости относительного количества различных ионов от отношения m/z. Сигнал, отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такой сигнал называется изотопным профилем, а пик (по крайней мере, для небольших молекул), представляющий наиболее распространённые изотопы для каждого атома, - моноизотопным пиком.
Масс-спектрометрический анализ даёт важную качественную (определение молекулярных масс; информация, касающаяся структуры определяемых фрагментов) и количественную (с использованием внешнего или внутреннего стандартов) информацию с пределом обнаружения от пикомоля до фемтомоля.
ВВОД ОБРАЗЦА
Первой стадией анализа является ввод образца в прибор без значительного нарушения вакуума. В широко распространённом методе, называемом прямым вводом жидкости, образец помещается на конец цилиндрического штока (в кварцевом тигле, на проволоке или на металлической поверхности). Этот шток через вакуумный шлюз, в котором поддерживается первичный промежуточный вакуум между атмосферным давлением и вторичным вакуумом прибора, вводится в спектрометр.
Другие системы ввода позволяют проанализировать компоненты смеси, так как они разделяются с помощью соответствующего прибора, соединённого с масс-спектрометром.
Газовая хроматография/масс-спектрометрия. При использовании подходящих колонок (капиллярных или полукапиллярных) возможно непосредственное введение конца колонки в ионный источник прибора без применения сепаратора.
Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия. Такая комбинация особенно полезна для анализа полярных соединений, которые являются недостаточно летучими либо слишком термолабильными, для того чтобы их можно было проанализировать методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Данный метод осложняется трудностью получения ионов в газовой фазе из жидкой фазы, что требует применения специальных интерфейсов, таких как:
прямой жидкостный ввод: подвижная фаза распыляется и растворитель испаряется перед ионным источником прибора,
интерфейс с пучком частиц: подвижная фаза, скорость которой может достигать 0,6 мл/мин, распыляется в десольватационной камере, в результате в ионный источник прибора попадают лишь анализируемые вещества в нейтральной форме; данный способ может быть использован для соединений с относительно низкой полярностью и молекулярными массами меньше 1000 Да,
интерфейс с движущейся полосой: подвижная фаза, скорость которой может достигать 1 мл/мин, наносится на поверхность движущейся полосы; после выпаривания растворителя анализируемые вещества переносятся к ионному источнику прибора, где подвергаются ионизации; данный способ плохо подходит для очень полярных или термолабильных соединений.
Другие виды интерфейсов (электрораспыление, термораспыление, химическая ионизация при атмосферном давлении) могут рассматриваться как самостоятельные методы ионизации и описаны в разделе, посвящённом способам ионизации.
Сверхкритическая флюидная хроматография/масс-спектрометрия.
Подвижная фаза, обычно состоящая из находящегося в сверхкритическом состоянии диоксида углерода, переходит в газообразное состояние после прохождения через нагретую заслонку, находящуюся между колонкой и ионным источником.
Капиллярный электрофорез/масс-спектрометрия. Элюент вводится в ионный источник, в некоторых случаях после добавления дополнительного растворителя, для того чтобы достичь скорости потока порядка нескольких миллилитров в минуту. Ограничениями данного метода являются малые количества вводимого образца и необходимость использовать летучие буферные растворы.
СПОСОБЫ ИОНИЗАЦИИ
Электронный удар. Образец, находящийся в газообразном состоянии, ионизируется потоком электронов, энергия которых (обычно 70 эВ) больше энергии ионизации образца. При этом кроме молекулярного иона M+ образуются осколочные ионы характерные для данной молекулярной структуры. Главным ограничением данного способа является необходимость испарения образца, что делает невозможным его применение для полярных, термолабильных или высокомолекулярных соединений. Ионизация электронным ударом может быть использована в газовой хроматографии, соединённой с масс-спектрометрией, а в некоторых случаях и в жидкостной хроматографии.
Химическая ионизация. Этот тип ионизации предполагает использование реагентного газа, такого как метан, аммиак, монооксид азота, диоксид азота или кислород. Спектр характеризуется ионами (M + H)+ или (M - H)- типов или ионами-аддуктами, образованными из аналита и используемого газа. Осколочные ионы образуются реже, чем при ионизации электронным ударом. Для термолабильных веществ используется разновидность данного метода ионизации, при которой образец, находящийся на проволоке, очень быстро испаряется вследствие эффекта Джоуля-Томсона (десорбционная химическая ионизация).
Бомбардировка быстрыми атомами (FAB) или ионизация бомбардировкой быстрыми ионами (жидкостная масс-спектрометрия вторичных ионов -LSIMS). Образец, растворённый в вязкой матрице, например в глицерине, наносится на металлическую поверхность и ионизируется потоком нейтральных атомов, например, аргона или ксенона или обладающими большой кинетической энергией ионами цезия. Образуются ионы (M + H)+ или (M - H)- типов либо ионы-аддукты, сформированные матрицей или образцом. Данный тип ионизации хорошо подходит для полярных, термолабильных соединений, имеющих молекулярную массу до 10000 Да. При добавлении к подвижной фазе 1 - 2% глицерина он может быть использован для жидкостной хроматографии, однако скорость подвижной фазы должна быть очень низкой (несколько микролитров в минуту). При нанесении тонкого слоя матрицы на поверхность хроматографических пластинок такой способ ионизации может быть использован и в тонкослойной хроматографии.
Полевая десорбция или полевая ионизация. Образец испаряется около вольфрамовой проволоки, покрытой микроиглами (полевая ионизация) или помещается на эту проволоку (полевая десорбция). Сильное электрическое поле (напряжение около 10 кВ), возникающее между проволокой и противоэлектродом, ионизирует образец. При данных способах ионизации образуются преимущественно молекулярные ионы M+ и (M + H)+ ионы. Эти способы используются для малополярных и/или термолабильных соединений.
Лазерная десорбция - ионизация с помощью матрицы (MALDI). Образец смешанный с подходящей матрицей и помещённый на металлическую подложку, ионизируется импульсным лазерным излучением с длиной волны от УФ- до ИК-диапазона (продолжительность импульсов может составлять от пикосекунды до нескольких наносекунд). Данный способ ионизации играет важную роль при анализе соединений с очень большой молекулярной массой (более чем 100 000 Да), но ограничен использованием времяпролётного анализатора (см. ниже).
Электрораспылительная ионизация. Данный способ ионизации проводится при атмосферном давлении. Образец, находящийся в растворе, вводится в источник через капилляр, конец которого имеет потенциал порядка 5 кВ. Для облегчения распыления может использоваться газ. Испарение молекул растворителя из образующихся микрокапель приводит к образованию в газовой фазе однозарядных или многозарядных ионов. Скорости подвижной фазы при данном виде ионизации могут изменяться от нескольких микролитров в минуту до 1 мл/мин. Такая ионизация подходит для полярных соединений, а также для исследования биомолекул с молекулярными массами до 100 000 Да. Она может сочетаться с жидкостной хроматографией или капиллярным электрофорезом.
Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). Ионизация проводится при атмосферном давлении под действием электрода, имеющего потенциал несколько киловольт и помещённого на пути подвижной фазы, которая распыляется как вследствие тепловых эффектов, так и благодаря использованию потока азота. Образующиеся ионы являются однозарядными и относятся к (M + H)+ типу в случае положительного заряда и к (M - H)- типу в случае отрицательного. Возможность использования высоких скоростей подвижной фазы (до 2 мл/мин) делает этот способ ионизации идеальным для сочетания с жидкостной хроматографией.
Термораспылительная ионизация. Образец, находящийся в подвижной фазе, состоящей из воды, органических модификаторов и содержащей летучий электролит (обычно ацетат аммония) вводится в распыленной форме после прохождения через металлический капилляр, температура которого контролируется. Допускаются скорости подвижной фазы порядка 1 мл/мин - 2 мл/мин. Ионы электролита ионизируют анализируемое соединение. Такой процесс ионизации может быть заменён или усилен электрическим разрядом величиной около 800 вольт, особенно при использовании только органического растворителя. Данный способ ионизации может быть использован в методе жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.
АНАЛИЗАТОРЫ
Различия в работе анализаторов зависят, главным образом, от двух параметров:
диапазон, в котором могут быть измерены отношения m/z (массовый диапазон),
разрешение, характеризуемое возможностью разделить два иона одинаковой интенсивности с отношениями m/z, отличающимися на AM и перекрывающиеся при определённом процентном превышении базовой линии; например, разрешение (M/AM) равное 1000 с 10% превышением базовой линии позволяет провести разделение отношений m/z 1000 и 1001 с интенсивностями, на 10% превышающими базовую линию. В некоторых случаях (времяпролётные анализаторы, квадрупольные анализаторы, ионные ловушки) разрешение может быть определено как отношение между молекулярной массой и шириной пика на половине высоты (50% превышение базовой линии).
Магнитные и электростатические анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются потенциалом V и сосредотачиваются, в зависимости от устройства прибора, между магнитным (магнитное поле B) или электростатическим анализаторами (электростатическое поле E). В соответствии с законом Лапласа они перемещаются по траектории с радиусом г m / z =2V
Для накопления и измерения различных ионов, образовавшихся в источнике, могут быть использованы два типа сканирования: изменение B при постоянной величине V или изменение V при постоянной величине B. За магнитным анализатором обычно следует электрический сектор, который действует как фильтр кинетической энергии и позволяет заметно увеличить разрешение прибора. Максимальное разрешение такого прибора (двойной сектор) изменяется от 10000 до 150000 и в большинстве случаев позволяет достаточно точно оценить величину отношений m/z для определения элементного состава соответствующих ионов. Для однозарядных ионов массовый диапазон равен от 2000 до 15000 Да. Некоторые ионы могут разрушаться спонтанно (метастабильные переходы) или при столкновении с газом (диссоциация, активированная столкновением (CAD)) в областях между ионным источником и детектором, где отсутствует поле. Исследование этих процессов разрушения очень полезно для определения структуры и характеристики определённого соединения, входящего в состав смеси, и делает возможным использование тандемной масс-спектрометрии. В зависимости от места, в котором протекают процессы разрешения, известно много методик, которые могут быть использованы для этого:
режим дочернего иона (определение состава ионов, образовавшихся при разрушении определённого родительского иона): B/E = константа, MIKES (Mass-analysed Ion Kinetic Energy Spectroscopy),
режим родительского иона (определение всех ионов, образовавшихся при разрушении иона с определённым отношением m/z): B2/E = константа,
режим нейтральных частиц (определение всех ионов, которые теряют идентичные фрагменты):
B/E(1 - E/E0)1/2 = константа, где E0 базовый потенциал электрического сектора.
Квадрупольные анализаторы. Анализатор состоит из четырёх параллельных металлических стержней, имеющих цилиндрическое или гиперболическое поперечное сечение. Они расположены симметрично по отношению к траектории движения ионов; пары противоположных стержней присоединены к электрическому источнику. Потенциалы двух пар стержней противоположны. Они состоят из постоянного и изменяющегося компонентов. Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, пропускаются и разделяются вследствие изменения потенциалов, приложенных к стержням, причём отношение постоянного потенциала к переменному должно оставаться неизменным. Квадрупольные анализаторы обычно имеют массовый диапазон от 1 атомной единицы массы до 2000 атомных единиц массы., хотя в некоторых случаях он может достигать 4000 атомных единиц массы. Несмотря на то, что такие анализаторы имеют меньшее разрешение, чем магнитные, они позволяют получать моноизотопный профиль однозарядных ионов, полученных во всём массовом диапазоне. Для получения спектров можно использовать три квадруполя, соединённых друг с другом, Q1, Q2, Q3 (Q2 служит ионизационной камерой, и в действительности не является анализатором; чаще всего в качестве ионизирующего газа применяют аргон).
Наиболее часто используемыми режимами сканирования являются:
режим дочернего иона: Q1 выбирает m/z ион, фрагменты которого, полученные при ионизации в квадруполе Q2, анализируются квадруполем Q3,
режим родительского иона: Q3 пропускает ионы только с определённым соотношением m/z, в то время как Q1 сканирует определённый массовый диапазон. Детектируются только ионы, при разрушении которых образуется ион, отбираемый квадруполем Q3.
режим нейтральных частиц: Q1 и Q3 сканируют определённый массовый диапазон, но в интервале, соответствующем фрагментам, которые теряет определённое вещество или группа веществ.
Для получения спектров возможно сочетание квадрупольных анализаторов с магнитными или электростатическими, такие приборы называют гибридными масс-спектрометрами.
Ионные ловушки. Данные анализаторы имеют такой же принцип работы, что и квадрупольные, но в них используются трёхмерные электрические поля. Анализаторы такого типа позволяют получать спектры ионов нескольких генераций
(MSn).
Циклотронно-резонансные масс-анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ячейке и подвергнутые действию интенсивного магнитного поля, движутся по круговым траекториям с частотами, которые могут быть непосредственно связаны с величинами отношений m/z для этих ионов при помощи преобразования Фурье. Данное явление называется ионно-циклотронным резонансом. Анализаторы такого типа состоят из сверхпроводящих магнитов и обладают очень высокой разрешающей способностью (до 1000000 и выше), а также позволяют получать MSn спектры. Их недостатком является необходимость использования очень глубокого вакуума (порядка 10-7 Па).
Времяпролётные анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются потенциалом величиной от 10 кВ до 20 кВ. Они проходят через анализатор, состоящий из бесполевой трубы длиной от 25 см до 1,5 м, обычно называемой пролётной трубой.
Время (t), за которое ион достигает детектора, пропорционально квадратному корню из отношения m/z. Теоретически массовый диапазон для такого анализатора бесконечен. Практически он определяется методом ионизации или десорбции. Времяпролётные анализаторы используются, главным образом, для высокомолекулярных соединений (вплоть до нескольких сотен тысяч дальтон). Данный способ ионизации обладает очень высокой чувствительностью (достаточно несколько пикомолей вещества). Точность измерений и разрешение таких приборов могут быть значительно улучшены при использовании электростатического зеркала (рефлектрона).
ПОЛУЧЕНИЕ СИГНАЛА
Имеются три возможных режима получения сигнала.
Режим полного спектра. Записывается полный сигнал, полученный для выбранного массового диапазона. Спектр представляет собой зависимость относительной интенсивности различных ионов от величины m/z. Получаемые результаты являются, главным образом, качественными. Для более быстрой идентификации возможно использование библиотек спектров сравнения.
Фрагментометрический режим (селективное сканирование ионов).
Получаемый сигнал ограничен одним (сканирование одного иона, single-ion monitoring (SIM)) или несколькими (множественное ионное сканирование, multiple-ion monitoring (MIM)) ионами, характерными для анализируемого вещества. В этом
режиме предел обнаружения значительно ниже. При использовании внутреннего или внешнего стандартов (например, дейтерированные стандарты) могут быть проведены количественные или полуколичественные измерения. При использовании времяпролётных анализаторов такие измерения невозможны.
Двойной фрагментометрический масс-спектрометрический режим (множественный мониторинг реакций, multiple reaction monitoring (MRM)).
Включает специфическую мономолекулярную или бимолекулярная реакцию разрушения выбранного иона-предшественника, характерного для анализируемого вещества. Селективность и высокая специфичность данного режима получения сигнала обеспечивают превосходную чувствительность и делают его наиболее подходящим для количественных определений с использованием подходящих внутренних стандартов (например, дейтерированных стандартов). Данный вид анализа может быть проведен только при использовании приборов, снабжённых тремя соединёнными квадруполями, ионными ловушками или циклотронно-резонансными анализаторами.
ГРАДУИРОВКА
Градуировка позволяет установить соответствие между величиной m/z и детектируемым сигналом. Как правило, она проводится с использованием вещества сравнения. Градуировка может быть внешней (данные находятся в другом файле) или внутренней (вещество (вещества) сравнения смешивается с исследуемым веществом и результаты вносятся в файл с данными анализа). Число ионов или точек, необходимое для надёжной градуировки, зависит от типа анализатора и требуемой точности измерений, например, в случае магнитного анализатора, где отношение m/z экспоненциально изменяется при изменении величины магнитного поля необходимо брать настолько много точек, насколько это возможно.
ОБНАРУЖЕНИЕ СИГНАЛА И ОБРАБОТКА ДАННЫХ
Ионы, разделённые анализатором, преобразуются в электрические сигналы такими детектирующими системами, как фотоумножитель или электронный умножитель. Затем данные сигналы усиливаются и превращаются в цифровые сигналы, которые используются при обработке данных и позволяют проводить различные операции: градуировку, получение спектров, автоматические количественные расчёты, архивирование данных, создание или использование библиотек масс-спектров. Различные физические параметры, требуемые для работы прибора, в целом контролируются компьютером
