Дезинтеграция - это процесс необратимого нарушения анатомической целостности клеток. С практической точки зрения необходимым и достаточным является разрыв клеточной оболочки, который может быть вызван различными повреждающими факторами: физическими, механическими, химическими, энзиматическими, биологическими. В природных условиях дезинтеграция клеток и клеточных систем вызывается внутриклеточными (внутренними) и внешними причинами. К внутренним причинам можно отнести факторы генетической природы. К различным внешним воздействиям можно отнести физические, физико-химические, химические и биологические факторы. Причем любой из этих факторов при достаточной интенсивности и продолжительности может стать дезинтегрирующим. Вызванную действием внутренних факторов дезинтеграцию обычно определяют как естественную. Наряду с естественной дезинтеграцией бывает искусственная (насильственная) дезинтеграция. Последняя целенаправленно применяется человеком и часто используется в научной и производственной деятельности.
Дезинтеграция биомассы (животной, растительной, микробной) для производства продуктов пищевого, кормового и технического назначения.
Дезинтеграция как способ стерилизации и инактивации живых систем.
Дезинтеграция как инструмент для направленного разрушения клеток и клеточных структур.
Дезинтеграция - разрушение клеток с помощью механического, физического, химического или иного воздействия с целью выделения их содержимого (напр., экстрагирования нуклеиновых кислот, белков и др.)
Дезинтеграция клеток применяется во многих сферах жизни человека, в частности в биотехнологии, для извлечения целевого продукта синтеза из биомассы.
Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.
Для отделения биомассы клеток или культуральной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр - прессы, вакуум - барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культирования, типа клеток, свойства культуральной жидкости.
Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобства этого способа - необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов окружающих среду, невозможность полного удаления клеток и среды.
Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды - фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляются за счет накопления клеток на поверхность фильтра. Увеличение давления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки забивают поры, образуя менее проницаемый слой.
Завершающие стадии биотехнологических процессов - выделение целевого продукта - существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.
Все методы дезинтеграции можно поделить на физические, химические и химико-ферментативные.
.1 Физические методы
бактериальный клетка мембрана дезинтеграция
К физическим методам дезинтеграции относятся: обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, баллистическое разрушение, продавливание с помощью пресса, измельчение твердой замороженной клеточной массы, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления).
·Обработка ультразвуком
Обработка ультразвуком является эффективным средством для разрушения клеточных структур. Этот эффект может быть использован для извлечения внутриклеточных материалов, например, крахмала из матричной клетки.
Ультразвуковая обработка попеременно генерирует волны высокого и низкого давления в обрабатываемой жидкости. Во время цикла низкого давления ультразвуковые волны создают мелкие вакуумные пузырьки, которые с силой лопаются во время цикла высокого давления. Данное явление носит название кавитации. Внутренний взрыв кавитационных пузырьков вызывает возникновение сильных гидродинамических сил сдвига.
Силы сдвига разделяют волокнистый клеточный материал на мелкие частицы и разрушают стенки клеточной структуры, высвобождая, тем самым, много внутриклеточного материала. Помимо этого, материал стенок клетки разрушается на мелкие осколки.
Данный эффект может быть использован для ферментации, выщелачивания и других процессов преобразования органических веществ. После размола и измельчения ультразвуковая обработка создаёт больше внутриклеточного материала; при этом в ферментах образуется осколки стенок клеток, которые преобразуют крахмал в сахарозу. Он также увеличивает площадь поверхности, подвергаемую воздействию ферментов во время разжижения или сахарообразования. Обычно это увеличивает скорость и выход дрожжевого брожения и других преобразовательных процессов.
Замораживание-оттаивание
Замораживание - оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам. Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах.
Для выделения больших количеств мембран полезна следующая методика. Густую суспензию отмытых клеток (клетки составляют около 30% объема суспензии) в 0,02 М трис-буфере, pH 7,8, содержащем 5 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,5 мг/мл лизоцима, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя, вращая колбу в ацетоновой бане с сухим льдом. Затем суспензию размораживают, погружая колбу в теплую воду, и, как только все растает, выливают содержимое в 20 объемов холодного буфера, имеющего состав: 0,02 М трис, 0,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы, pH 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки.
Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания - оттаивания с последующим разведением.
·Продавливание с помощью пресса
Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5-40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием; с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ.
Во-первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5-10°С, но эту жидкость можно быстро охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню.
Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы.
В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо воспроизводимых условиях. К тому же на степень разрушения не влияет плотность клеточной суспензии, фаза роста, в которой были собраны клетки, или среда, в которой клетки суспендированы.
Осмотический шок.
Осмотический шок - это повреждение или распад клеток, вызванные помещением их в гипотоническую или гипертоническую среду. Применяется для дезинтеграции клеток, имеющих малопрочную и высокопроницаемую клеточную оболочку. При этом происходит солевой шок, оболочка клеток, органелл, вирусов разрывается давлением воды, проникающей внутрь клетки. Клетки суспендируют в буферной гипертонической среде, содержащей ЭДТА, затем быстро переносят в охлажденную гипотоническую среду (на льду), центрифугируют, надосадок сливают. ЭДТА добавляют с целью разрушить липополисахариды клеточной стенки. Осмотический шок у некоторых бактерий наступает при переносе теплой культуры в холодный разбавитель.
2 Химические методы
Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.
Разрушение клеточных стенок таким методом включают обработку щелочью, органическими растворителями или детергентами. Если белковый продукт не разрушается при pH от 10,5 до 12,5, то можно без труда и дешево лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток?? E. coli обработкой гидроксидом натрия. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Обработка органическими растворителями - это простой и недорогой способ разрушения клеток, который используется для выделения ферментов из дрожжей. Однако чтобы убедиться в том, что в подобранных условиях белковый продукт не денатурирует, необходимо провести предварительное тестирование. Под действием детергентов в мембранах бактериальных клеток образуются поры, через которые белки и другие молекулы выходят из клетки. Недостатком детергентов является их дороговизна, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт
.3 Химико-ферментативные методы
К химико-ферментативным методам относятся использование антибиотиков, ферментов, ионогенные ПАВы.
) Эффективный лизис клеток вызывают антибиотики полимиксины, тироцидины, новобиоцин, нистатин и другие, некоторые поверхностно-активные вещества, а также глицин.
Можно использовать автолиз клеток при лимитированном по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагами. Последний вариант сопряжен с риском неконтролируемого распространения фага в промышленных установках и поэтому не получил применения.
