У результаті перемоги турків-османів у битві при Мохачі (1526) значну частину Угорщини було приєднано до Османської імперії. Трансільванія (Сомиграддя) потрапила у васальну залежність від Порти, а словацькі землі опинилися перед безпосередньою загрозою завоювання. Небезпека турецької окупації зросла також для Австрії та Чехії.
Вмілою дипломатією та вдалими династичними шлюбами Габсбурги забезпечили необхідні умови для остаточного загарбання Чеської та Угорської держав. З урахуванням усіх цих та інших обставин чеська знать у 1526 р. погодилася передати чеську корону австрійському королю Фердінанду Габсбургу (1526-1564).
Початок Реформації в Німеччині вплинув на поширення реформаторських ідей серед різних прошарків чеського суспільства. Частина бюргерів і рицарів продовжували дотримуватися вчення чашників, відомого під назвою новоутраквізм. Цьому певною мірою сприяла угода про віротерпимість, укладена 1485 р. (чашники зрівнювалися в правах з католиками).
В 20-х роках XVI ст. серед чеського населення поширилося лютеранство. З контр-реформаційною хвилею в чеських землях з'являються єзуїти.
На чеському сеймі в січні 1609 р. спалахнув конфлікт з приводу затвердження чеської конфесії 1575 р., однак питання залишилося нерозв'язаним
У 1610-1611 рр. боротьба між протестантами і католиками загострилася. В ході конфлікту було зруйновано кілька католицьких монастирів.
На початку листопада 1620 р. війська імператора підійшли до Праги. Здеморалізована армія станів протягом двох годин 8 листопада намагалася чинити опір імперським силам на схилах Білої Гори. Фрідріх Пфальцський утік до Сілезії. Поразка на Білій Горі остаточно засвідчила марність визвольних прагнень повстанців.
Невдача виступу 1618-1620 рр. призвела до втрати Чехією політичної незалежності. Габсбурги встановили порядки, які негативно позначилися на економічному, політичному, культурному й релігійному розвитку чехів.
Перемога в битві поблизу Білої Гори посилила позиції Габсбургів у Центральній Європі. Анти-габсбурзьке повстання чеських протестантських станів започаткувало Тридцятилітню війну (1618-1648), у якій брала участь більшість європейських країн. Вони виступали проти агресивних прагнень австрійських та іспанських Габсбургів.
У ході війни на початку 30-х років Габсбурги майже втратили контроль над чеськими землями, які захопив саксонський курфюрст. У 1631 р. саксонці навіть оволоділи Прагою. По всій Чехії прокотилася хвиля анти-габсбурзьких виступів.
Вступ шведських військ на територію Чехії в 1639 р. сприяв поширенню анти-габсбурзького руху протестантів.
Вестфальський мир 1648 р., який завершив Тридцятилітню війну і був укладений без участі чехів, закріпив позиції Габсбургів у цьому регіоні Європи й узаконив феодально-католицькі порядки. Саме в цей період відбулося тик зване повторне закріпачення селян.
