Лекция 4. Физиология и принципы культивирования микроорганизмов

План

1. Метаболизм микроорганизмов
2. Питание бактерий
3. Дыхание микроорганизмов
4. Принципы культивирование микроорганизмов
5. Светящиеся и ароматобразующие микроорганизмы
6. Рост и размножение бактерий
7. Пигменты микроорганизмов 

 

Физиологические и биохимические особенности микроорганизмов положены в основу их систематики. Они важны для изучения механизмов патогенного действия культивирования, дифференцировки и идентификации отдельных микроорганизмов а также для разработки биотехнологии производства вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов.

Метаболизм микроорганизмов

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих - анаболизм и катаболизм. Анаболизм - синтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм - энергетический обмен, связан с окислительно-восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ.

У прокариот, так же как у эукариот, в процессе ферментативных катаболических реакций происходит выделение энергии, которая аккумулируется в молекулах АТФ. В процессе ферментативных анаболических реакций эта энергия расходуется на синтез многочисленных макромолекул органических соединений, из которых в конечном итоге монтируются биополимеры — составные части микробной клетки. Взаимосвязь анаболизма и катаболизма выражается также в том, что на определенных этапах метаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.

Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) - осмотрофы, или в виде от­дельных частиц - фаготрофы.

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления ве­ществ:

-пассивная диффузия - по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

• облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энерго­незатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз;
• активный транспорт - против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;
• транслокация (перенос групп) - против градиента концентрации, с помощью фос-фотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступа­ют в клетку в форфорилированном виде.

Из бактериальной клетки

Синтезируемые в бактериальных клетках соединения выходят из них тремя путями:

1)  Фосфотрансферазная реакция. Происходит при фосфорилировании переносимой молекулы

2)  Контрансляционная секреция. В этом случае синтезируемые молекулы должны иметь особую лидирующую последовательность аминокислот, чтобы прикрепиться к мембране и сформировать канал, через который молекулы белка смогут выйти в окружающую среду. Таким образом выходят из клетки соответствующих бактерий токсины столбняка, дифтерии и другие молекулы.

3) Почкование мембраны. Молекулы, образующиеся в клетке, окружаются мембранным пузырьком, который отшнуровываются в окружающую среду.

Метаболизм микроорганизмов характеризуется ярко выраженным разнообразием. В качестве питательных веществ микробные клетки используют различные органические и минеральные соединения.

Питание бактерий

Особенностями питания бактериальной клетки являются поступление питательных субстратов внутрь через всю ее поверхность, а также высокая скорость процессов метаболизма и адаптации к меняющимся условиям окружающей среды.

Типы питания. Широкому распространению бактерий способствует разнообразие типов питания. Микроорганизмы нуждаются в углероде, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах.

Основные химические элементы- органогены, необходимые для синтеза органических соединений - углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на ау-тотрофы (используют СО2) и гетеротрофы (используют готовые органические соеди­нения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза - например, цианобактерии) и хемотрофы (энер­гия добывается за счет химических, окислительно- восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические - органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы.

Факторы роста

К факторам роста относят аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основание липиды, витамины, железопорфирины (тем) и другие соединения. Некоторые микроорганизмы самостоятельно синтезируют необходимые им ростовые факторы, другие получают их в готовом виде из окружающей среды.

Потребность того или другого микроорганизма в определенных ростовых факторах является стабильным признаком, который используется для дифференциации и идентификации бактерий, а также при изготовлении питательных сред для лабораторных и биотехнологических целей.

Аминокислоты. Многие микроорганизмы, особенно бактерии, нуждаются в тех или других аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать, например клостридии — в лейцине, тирозине, стрептококки — в лейцине, аргинине и др. Такого рода микроорганизмы называются ауксотрофными по тем аминокислотам или другим соединениям, которые они не способны синтезировать.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков, некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий. В нуклеотидах нуждаются некоторые виды микоплазм.

Витамины, главным образом группы В, входят в состав коферментов или их простетических групп. Многие бактерии ауксотрофны по определенным витаминам. Например, коринебактерии дифтерии, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав НАД и НАДФ, золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы — тиамине (В,), входящем в состав пирофосфата, некоторые виды стрептококков, бациллы столбняка — в пантотеновой кислоте, являющейся составной частью кофермента КоА и т.д. Кроме того, факторами роста для многих бактерий являются фолиевая кислота, биотин, а также гемы — компоненты цитохромов. Последние необходимы гемофильным бактериям, микобактериям туберкулеза и др.

Дыхание микроорганизмов

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание - биологический про­цесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образовани­ем АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделя­ют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором элек­тронов является молекулярный кислород (02), при анаэробном - связанный кислород (-Х03, =S04, =S03).

Примеры.

Аэробное дыхание  донор водорода →

Анаэробное дыханиенитратное окисление

(факультативные анаэробы) донор водорода →

сульфатное окисление

(облигатные анаэробы)  донор водорода →

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1. Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) ки-' слород для дыхания.
2. Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культи­вирования обычно добавляют С02, например до 10- процентной концентрации.
3. Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относитель­но высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях пе­реключаться с анаэробного на аэробное дыхание.
4. Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процес­сов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее коли­чество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (Н202-перекись водорода, -02 - свободные кислородные радикалы), от которых защищают спе­цифические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно- восста­новительного потенциала (rH2)

Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов.

1. Физический - откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще- N2- 85%, С02- 10%, Н2- 5%).
2. Химический - применяют химические поглотители кислорода.
3. Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэро­бы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).
4. Смешанный - используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов - очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания раство­ренного кислорода, поддержание необходимого окислительно - восстановительного по­тенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэро­бов - предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, за­ливка хред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование гер­метически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. Од­нако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система "Газпак" со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

Принципы культивирования бактерий

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов - риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на пита­тельных средах при температуре 37 °С в течение 1-2 суток. Однако некото­рые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии кок­люша - в 2-3 сутках, а микобактерии туберкулеза - в 3-4 неделях.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и пере­мешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое примене­ние в биотехнологии.

Основные принципы культивирования микроорганизмов

на питательных средах.

1. Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.
2. Оптимальные температура, рН, гН2, концентрация ионов, степень насыщения ки­слородом, газовый состав и давление.
3. Концентрация ионов водорода. Ионы Н+ и ОН- наиболее подвижны из всех ионов, поэтому уже малейшие изменения их концентрации оказывают на микроорганизмы сильное влияние. Поэтому поддержание заданной оптимальной величины рН имеет существенное значение для роста. Большинство микроорганизмов лучше растет при рН 7.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной темпера­туре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1. Психрофилы - растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.
2. Мезофилы - растут в диапазоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум-при 37 градусах С).

3. Термофилы - растут при температурах выше плюс 45 градусов.
Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды.

Агар - полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота при­меняют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты-мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

• универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорга­низмов (мясо-пептонный бульон - МПБ, мясо-пептонный агар - МПА);
• специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак-Коя на туляремию, среда Левенштейна-Иенсена для возбудителя туберкулеза);
• дифференциально-диагностические - для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);
• селективные (элективные) - для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих - пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетиче­ские.

Для получения плотных питательных сред к жидким питательным растворам добавляют особые вещества которые предают им железообразную консистенцию. Желатину применяют в отдельных случаях, т.к. она имеет нижнюю точку плавления 26-30 градусов, кроме того разжижается  многими микроорганизмами.

Идеальным средством является агар, который Гессе, сотрудник Р. Коха ввел бактериологическую практику в 1883 году.

Агар  - полисахарид сложного состава из морских водорослей, добавляют к водным растворам 15-20 гр. на литр, температура плавления 1000С, остается жидким до 450С, применяет также силикогель в тех случаях, когда требуются плотные среды не содержащие органические компоненты.  

Светящиеся и ароматообразующие микроорганизмы

Некоторые бактерии, вибрионы и грибы обладают способностью све­титься (лгоминеецировать). Они вызывают свечение тех субстратов, напри­мер чешуи рыб, высших грибов, гниющих деревьев, пищевых продуктов, на поверхности которых размножаются. Большинство светящихся бактерий от­носятся к галофильным видам, способным размножаться при повышенных, концентрациях солей. Они обитают в морях и океанах и редко - в пресных водоемах. Все светящиеся бактерии являются аэробами. Механизм свечения связан с освобождением энергии в процессе биологического окисления суб­страта.

Свечение пищевых продуктов, вызванное бактериями, не приводит к их порче. Более того, оно свидетельствует об отсутствии в этих продуктах процесса гниения, поскольку свечение прекращается при развитии гнилост­ных микроорганизмов.

Некоторые микроорганизмы вырабатывают летучие ароматические вещества, в.Еапример уксусноэтиловый и уксусноамиловый эфиры, которые придают аромат вину, пиву, молочнокислым и другим пищевым продуктам, вследствие чего применяются в их производстве.

Рост и размножение бактерий

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом - формировани­ем структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки и размножением - самовоспроизведением, приводя­щим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже пу­тем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток. Грамположительные бактерии делятся путем врастания синтезирующихся перегородок деления внутрь клетки, а грамотрицательные - путем перетяжки, в результате образования гантелевидных фигур, из которых образуются две одинаковые клетки.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде.

Бактерии, засеян­ные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножа­ясь потребляют питательные элементы, что приводит в дальнейшем к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим культивированием, а культуру - периодической. Если же условия культивирования поддержива­ются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура - непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузный или поверхностный (в виде пленки) рост культуры. Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов: 1) лаг-фаза; 2) фаза логарифмического роста; 3) фаза стационарного роста, или максималь­ной концентрации бактерий; 4) фаза гибели бактерий. Эти фазы можно изо­бразить графически, в виде отрезков кривой размножения бактерий, отра­жающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени их культи­вирования. Лаг-фаза (от англ. lag - запаздывание) - период между посевом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4-5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; увеличивается количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин­тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5-6 ч. При опти­мальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20-40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувст­вительностью компонентов метаболизма интенсивно растущей клетки к ин­гибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и другие. Затем наступает фа­за стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток ос­тается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, особенностей, культивирования. Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов ме­таболизма бактерий. Продолжительность ее колеблется от десятка часов до нескольких недель. Интенсивность роста и размножения, бактерий зависит от многих факторов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, рас­тущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями (S= и R-формы), различ­ной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают ее, например, синегнойная палочка окрашивает среду в синий цвет. Другая группа пигментов не растворима в воде, но растворима в орга­нических растворителях. Так, колонии «чудесной палочки» имеют кроваво-красный пигмент, растворимый в спирте. И, наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пигменты как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины, наряду с каталазой, супероксидисмутазой и пероксидазами, защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиотикоподобным действием.

Вид, форма, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде могут учитываться при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получения чистых культур.

В промышленных условиях, при получении биомассы микроорганиз­мов с целью приготовления антибиотиков, вакцин, диагностических препара­тов, эубиотиков, культивирование бактерий и грибов осуществляют в ферментерах при строгом соблюдении оптимальных параметров.

 

 

 

Пигменты

Многие микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности синте­зируют пигменты, различающиеся по цвету, химическому составу и раство­римости.

Жирорастворимые, каротиноидные пигменты красного, оранжевого или желтого цветов образуют сарцины, микобактерии туберкулеза, некото­рые актиномицеты. Эти пигменты предохраняют их от действия УФ-лучей. Нерастворимые в воде и даже сильных кислотах пигменты черного или ко­ричневого цвета - меланины - синтезируются облигатными анаэробами Bacteroldles nlger и др. К пирроловым пигментам ярко-красного цвета отно­сится продигиозин, образуемый некоторыми еерациями. Водорастворимые фенозиновые пигменты, например пиоцианин, продуцируются синегнойными бактериями (Pseudomonas aeruginosa). При этом питательная среда с ней­тральным или щелочным рН окрашивается в сине-зеленый цвет.

Цвет пигмента используется в качестве теста для идентификации пигментообразующих бактерий.