Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1—1,5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур, м/озмов фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.
Приготовление отпечатков
В связи с возросшим интересом в последние годы к изучению тонкого строения бактерий были разработаны разнообразные и эффективные способы фиксации бактерий, нанесенные на стекло в виде отпечатков. В таком препарате-отпечатке сохраняется более или менее точно взаимное расположение клеток в бактериальном газоне. Метод отпечатков заключается в том, что из агара в чашке Петри с засеянными на нем бактериями вырезают блок и переносят на предметное стекло. Затем берут обезжиренное предметное стекло и прикладывают его к поверхности блока, засеянного бактериями, получая таким образом первый отпечаток. Отпечатки делают до тех пор, пока не истощится слой бактерий на блоке, располагая их слева направо, начиная от левой короткой грани стекла. Затем дают отпечаткам подсохнуть и помещают стекло в жидкость Карнуа для фиксации. Хорошие результаты дает также фиксация осмиевой кислоты. В литературе описаны и другие методы фиксации отпечатков.
В бактериологической работе способы окраски препаратов делят на две группы: ориентировочные простые «краски и окраски дифференциальные, выявляющие химические и структурные особенности бактерий.
а) Ориентировочная окраска
Ориентировочная окраска бактерий, выявляющая только их морфологию, хорошо удается:
1) разведенным (1 : 10) карболовым фуксином—10—30 секунд;
2) Метиленовым синим Леффлера — 3—10 минут;
3) спиртово-водным раствором метиленового синего — 3—5 минут;
4) водным раствором метиленового синего — 5—10 минут.
б) Дифференциальная окраска
Наиболее употребительной среди дифференциальных окрасок является окраска по Граму.
При этом методе выявляется способность бактерий удерживать краситель или обесцвечиваться в спирте, что связано с химической структурой микробной клетки.
Для выполнения окраски по Граму надо приготовить следующие растворы.
Карболовый раствор генцианвиолета или кристалвиолета: красителя 1 г, 96° спирта 10 мл, кристаллической карболовой кислоты 2 г, дистиллированной воды 100 мл. Растирают в ступке краситель с карболовой кислотой до кашицы, прибавляют небольшими порциями спирт и окончательно разводят водой. Сливают в бутыль, оставляют на сутки, затем фильтруют. Или: насыщенного (4,8%) спиртового раствора красителя 10 мл, 2% карболовой воды 100 мл.
Раствор Люголя (в модификации Грама): йодистого калия 2 г, дистиллированной воды 10 мл, йода кристаллического 1 г. Смесь хорошо закупоривают, оставляют на сутки, после чего добавляют дистиллированной воды до 300 мл.
