Останні десятиліття XX століття ознаменувалися бурхливим розвитком однієї з головних гілок біологічної науки - молекулярної генетики. Вже на початку 70-х років учені в лабораторних умовах почали отримувати та клонувати рекомбінантні молекули ДНК, культивувати в пробірках клітини і тканини рослин і тварин. Виник новий напрям генетики генетична інженерія.На основі її методології почали розроблятися різного роду біотехнології, створюватися генетично змінені організми (ГМО).З'явилася можливість генної терапії деяких захворювань людини, а останнє десятиліття XX століття ознаменувалося ще однією важливою подією - досягнутий величезний прогрес в клонуванні тварин із соматичних клітин.
Особливо великий резонанс у світової громадськості отримали дослідження шотландських вчених з Рослінського Університету, яким вдалося з клітини молочної залози вагітної вівці отримати генетично точну її копію. Клонована вівця на прізвисько Доллі нормально розвивалася і привела на світ спочатку одного, а потім ще трьох нормальних ягнят. Слідом за цим з'явилася низка нових повідомлень про відтворення генетичних близнюків корів, мишей, кіз, свиней із соматичних клітин цих тварин. У приматів, зокрема, у мавп поки не вдалося отримати клони з використанням клітин дорослого організму, плоду або навіть ембріональних стовбурових клітин.
Проте роботи в цьому напрямку активно ведуться. У минулому році з'явилося повідомлення про клональне розмноженні потомства приматів шляхом ділення зародка. Американським дослідникам вдалося отримати генетично ідентичні ембріони мавпи резус шляхом поділу бластомерів зародка на стадії поділу. З ембріона народилася цілком нормальна мавпочка Тетра.
Такий тип клонування забезпечує генетично ідентичне потомство, і в результаті можна отримати двійню, трійню і більше генетичних близнюків. Це дозволяє проводити теоретичні дослідження щодо ефективності нових методів терапії тих чи інших захворювань, з'являється можливість повторювати наукові експерименти на абсолютно генетично ідентичному матеріалі.Імплантіруя зародки послідовно однієї і тієї ж сурогатної самці, можна досліджувати вплив її організму на розвиток плода [31].
Розроблені методи клонування тварин поки ще далеко не досконалі. У процесі експериментів спостерігається висока смертність плодів і новонароджених. Ще не ясні багато теоретичні питання клонування тварин з окремої соматичної клітини.
Проте успіх, досягнутий в клонуванні вівці і мавп, показав теоретичну можливість створення генетичних копій також людини з окремої клітини, взятої з якого-небудь його органу. Багато вчених з ентузіазмом сприйняли ідею клонування людини.
3.1 Методи трансплантації ядер
У нашій країні Б.В. Конюховим і Є.С. Платоновим в 1985 р. був розроблений метод менш травматичного перенесення ядер методом мікроманіпуляції. Він протікає в два етапи: спочатку тонкою мікропіпеткою проколюють зони пеллюціда і плазматичної мембрани і витягають пронуклеус, а потім інший піпеткою, більшого діаметру (12 мкм) у той же отвір вводять диплоидное ядро донора. У цьому випадку менше травмується цитоплазма зиготи і транспортується ядро донора.
Трансплантація ядер може здійснюватися й іншим способом, з використанням цітохалазінов (речовин, синтезованих грибами).
Цітохалазін У руйнує структуру мікрофіламентів і сприяє унікальному розташуванню ядра. Ядро залишається з'єднаним з клітиною тоненьким стеблинкою цитоплазми. При центрифугуванні цей місток розривається, утворюються без'ядерні клітини (цітопласти) і каріопласти, що представляють собою ядра, оточені тонким шаром цитоплазми і цитоплазматичною мембраною.Цітопласти відокремлюють від інтактних клітин в градієнті щільності. Вони зберігають здатність прикріплятися до поверхнікультурального судини і можуть бути використані для злиття з каріопластамі інших клітин з метою отримання життєздатної клітини [14] [12].
Методи виділення каріопластов трохи складніше і включають в себе ряд операції з центрифугированию, розділення в градієнті щільності і т.д. У деяких випадках до суміші клітин і каріопластов додають частки танталу діаметром 1 - 3 мкм. Вони проникають у клітини і ніколи в каріопласт, тому більш важкі клітини осідають швидше каріопластов.
Цітопласти містять всі види органел, властиві нормальній клітині, зберігають здатність прикріплюватися до субстрату, утворювати складчасту мембрану, пересуватися, здійснювати пиноцитоз.
Каріопласти оточені тонким шаром цитоплазми (близько 10% від усієї клітинної цитоплазми), містять компактний ендоплазматичний ретикулум, кілька мітохондрій і рибосом. У деяких клітинних ліній 1 / 10 каріопластов здатна відновити весь втрачений об'єм цитоплазми і відновитися в життєздатні клітини.
Для реконструкції клітин суспензію каріопластов в сольовому буфері додають до моношар культури цітопластов з пропорції 100 каріопластов на 1 цітопласт. Цітопласти повинні бути вже покриті інактивованими вірусними частинками.Інкубують при температурі 4оС 45 хвилин, а потім ще 45 хвилин при температурі 37оС. Відмивають розчином Ерла для видалення не злилися кріопластов. ( sequence and ligation - independent cloning ) метод клонирования 3.2 SLIC (sequence and ligation - independent cloning) метод клонування
Стів Елледж і невтомна Мамі Лі в черговий раз порадували наукове співтовариство оригінальним методом клонування.Новий метод отримав Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы. назва SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка є модифікацією відомого методу LIC (ligation-independent cloning) - клонування без використання лігази. Для того щоб вставити фрагмент ДНК у вектор за допомогою класичного методу LIC, достатньо змішати вектор і вставку, на кінцях яких розташовані протяжні одноланцюгові ділянки, комплементарні один одному. При цьому вставка "прилипає" до вектора, утворюючи рекомбіновану плазміду з ніками в обох ланцюгах. Отриманою плазмидой трансформують Е.coli, система репарації якої відновлює нормальну структуру плазміди.
Метод SLIC - це те ж саме, що і LIC з єдиною різницею: "злипання" вектора і вставки проводять в присутності білка RecA.Ця незначна модифікація методу дозволяє домогтися досить високого виходу (1 нг. Вектора здатний дати 3900 трансформантів) а також спростити саму процедуру клонування. Так якщо для класичного методу LIC необхідно точно підігнати розмір одноланцюгових ділянок у вектора і вставки (щоб у підсумку на стику вектора і вставки вийшли ніки), то метод SLIC допускає наявність протяжних гепів [19].
Фактор RecA-один із ключових факторів репарації та рекомбінації E.coli. Зв'язуючись з одноланцюговим ділянкою ДНК, RecA стимулює процес "strand exchange" (в ході цього процесу одноланцюговий ділянка однієї молекули ДНК вбудовується в гомологічний двухчепочений ділянку іншої молекули ДНК, утворюючи D-петлю). Очевидно, додавання RecA in vitro на кроці клонування дозволяє E.coli ефективніше репарирувати плазміду in vivo.
Для успішного клонування необхідна наявність 30-ти нуклеотидних ділянок гомології по краях вектора і вставки.Отримувати одноланцюгові ділянки пропонується за допомогою T4 ДНК-полімерази без додавання нуклеотидів. За допомогою SLIC в один вектор можна запхнути відразу 5 вставок в одну стадію без зниження виходу. Нарешті, високий вихід дозволяє використовувати метод SLIC при клонуванні бібліотек [7].
3.3 Метод генетичного перепрограмірованія клітин шкіри
Розроблено новий метод клонування - менш трудомісткий, ніж спосіб, завдяки якому була створена овечка Доллі. У зв'язку з цим виникли побоювання, що одного разу він буде використаний для обробки ембріонів людини, щоб формувати дітей "на замовлення".
Вчені, завдяки цьому методу отримали мишенят з клітин шкіри дорослих особин, виявили: така технологія набагато ефективніша, ніж спосіб створення Доллі, а побічних ефектів у неї менше - отже, вона краще підходить для використання стосовно людини.
Для клонування мишей вчені вводили клітини шкіри, взяті у дорослої особини, у тканини ембріона на ранній стадії розвитку, отриманого шляхом екстракорпорального запліднення (ЕКЗ). Деякі з дитинчат виявилися частковими клонами особин-донорів, а деякі, як і Доллі, стовідсотковими.
Однак, на відміну від "методу ім'я Доллі", цей спосіб настільки простий і ефективний, що виникли побоювання: в клініках, де практикується ЕКО людини, їм можуть скористатися для допомоги безплідним подружнім парам, які мріють про повністю "своєму" в біологічному відношенні дитину [11].
Метод передбачає генетичне перепрограмування клітин шкіри, в результаті якого вони повертаються в квазіембріональное стан. У минулому році, коли ця революційна методика вперше була застосована до клітин шкіри людини, Католицька церква і президент Джордж Буш високо оцінили її як морально-прийнятний спосіб отримання ембріональних стволових клітин, не пов'язаний з необхідністю створювати або знищувати людські ембріони [13].
Однак той же метод вже використовується в інших цілях - для відтворення потомства лабораторних мишей, яке є або стовідсотковими клонами, або генетичними "химерами" дорослих мишей, клітини шкіри яких зазнали перепрограмуванню.
Експерименти на мишах показали, що в принципі тепер можливо взяти клітину шкіри людини, перепрограмувати її дляповернення в ембріональний стан, а потім ввести її в ембріон людини на ранній стадії. У результаті вийде дитина, що володіє деякими загальними генами не тільки з батьками ембріона, але і з людиною, у якого були взяті клітини шкіри.
Така дитина є химерою - генетичною "поміссю" двох або більшої кількості особин - так як деякі з його клітин походять від ембріона, а інші - від клітини шкіри. Фактично у такої дитини буде три біологічних батьків. Відомі химери людини, що виникають в природних умовах - коли в матці з'єднуються двох ембріонів. Часто подібні люди є абсолютно нормальними і здоровими. За словами доктора Ланца, немає причин припускати, що люди-химери, створені за допомогою нового методу, будуть нездорові.
Більш того, експерименти на мишах показали, що можливо створювати повні клони - дитинчат, які на 100% ідентичні дорослої особини в генетичному плані. Цього вдалося досягти, використовуючи різновид дефективних ембріонів мишей з чотирма наборами хромосом замість нормального числа - двох.
Цей "тетраплоїдних" ембріон, розвиваючись, перетворювався виключно в плаценту плоду, коли ж у нього ввели перепрограмувати клітини шкіри, інша частина плоду розвинулася з цієї єдиної клітини і зробилася стовідсотковим клоном дорослої особини, шкіра якої використовувалася [15].
Ніхто з учених, які розробляють методи перепрограмування клітин для виробництва індукованих плюрипотентних стовбурових клітин (induced pluripotent stem, скорочено iPS) - так називають ембріональні клітини - не планує застосовувати їх в репродуктивній медицині людини. Головна мета вчених - налагодити виробництво стовбурових клітин для терапевтичного лікування таких захворювань, як хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера та інсульт [3].
