Молекуля́рне клонува́ння — група методів у молекулярній біології та біотехнології, пов'язаних зі створенням рекомбінантних молекул ДНК і отриманням багатьох копій цієї молекули in vivo. Термін "клонування" в даному випадку означає, що з однієї клітини, що містить рекомбінантну молекулу ДНК, шляхом мітотичного поділу утворюється велика кількість ідентичних за генетичною інформацією клітин - клонів.
Клонування часто використовується для ампліфікації фрагмента ДНК, що містить гени, але може використовуватися і для ампліфікації будь-якої послідовності ДНК, наприклад промоторів, некодуючих послідовностей і випадкових фрагментів ДНК. Молекулярне клонування широко використовується в багатьох біологічних експериментах та находить багато практичних застосувань, наприклад виробництво білків у значній кількості.
Молекулярне клонування пов'язане з процедурою субклонування, тобто переміщення фрагмента ДНК (зазвичай гену) з одного вектора до іншого. Іноді термін неправильно використовується, посилаючись на процес позиційного клонування, тобто визначення хромосомного розташування гена, пов'язаного із певним фенотипом. На практиці, локалізація гена на хромосомі або в регіоні геному не обов'язково надає можливість ізолювати його послідовність.
Для проведення процедури молекулярного клонування потрібно, по-перше, вибрати біологічний об'єкт, де необхідна нуклеотидна послідовність буде реплікуватись. Для молекулярного клонування можуть застосовуватись як прокаріотичні, так і еукаріотичні організми, в залежності від задачі, яку необхідно вирішити. Найчастіше в лабораторіях використовуються кишкова паличка Escherichia coli та дріжджі Saccharomyces cerevisiae відповідно.
По-друге, необхідно обрати вектор для клонування. Векторна молекула повинна відповідати декільком обов'язковим умовам: 1) вектор повинен тривалий час існувати в популяції клітин-господарів (тобто реплікуватись або автонономно, або разом з хромосомами клітин); 2) має містити біохімічні або генетичні маркери, які дозволяли виявляти його у клітинах; 3) структура молекули повинна допускати вбудування в неї нуклеотидної послідовності без порушення її функціональної цілісності.[5] Для конструювання векторів використовують плазміди, вірусні послідовності ДНК, а також фрагменти хромосом еукаріотичних клітин. Сучасні векторні системи дозволяють створювати рекомбінантні молекули, що здатні нести у своєму складі послідовності довжиною до кількох сотень тисяч нуклеотидів (так звані штучні хромосоми).
Стандартна процедура клонування включає в себе 4 базових кроки:[6]
1) Виділення послідовностей чужорідної ДНК; 2) Вставлення чужорідної ДНК у вектор - створення рекомбінантної ДНК; 3) Трансформація рекомбінантної ДНК-молекули в клітину-господаря, де може вона зможе реплікуватись; 4) Скринінг отриманих клонів для індентифікації клітин, що містять необхідну рекомбінантну молекулу.
Отримання чужорідної ДНК
Існує велика кількість методів отримання геномної ДНК з клітин, але всі вони мають кілька загальних кроків.[7] Вони включають в себе наступне: 1) лізис клітин або тканин, звідки ДНК має бути виділена; 2) очищення від білків та РНК; 3) преципітація ДНК за допомогою ізопропанолу або етанолу. Для виділення ДНК з органел (пластиди, мітохондрії) застосовують окремі методики, що включають в себе ультрацетрифугування або центрифугування в градієнті щільності сахарози. [8]
Часто для дослідження еукаріотичних генів береться не геномна ДНК, а інформаційна РНК, на матриці якої за допомогою ПЛР зі зворотньою транскрипцієюутворюється комплементарна ДНК (кДНК), тобто послідовність еукаріотичного гену, в якому відсутні інтрони. Це дозволяє зменшити довжину клонованої послідовності без зміни при подальшій експресії у первинній структурі білка. Процедура виділення тотальної РНК загалом подібна до виділення ДНК, однак має певні особливості.[9] Так, якщо ДНК представлена в клітинах в рівній мірі, то наявність і рівень експресії конкретної РНК, як правило, варіює в різних органах і тканинах. Другою особливостю є малий час існування мРНК: бактеріальна мРНК дуже нестабільна, період напіврозпаду - кілька хвилин; період напіврозпаду еукаріотичної мРНК вимірюється годинами і добами.[10]
Створення рекомбінантної ДНК
Після виділення ДНК, її ділять на фрагменти, які будуть підлягати клонуванню. Для цього можуть застосовуватись фізичні методи (ультразвукова обробка), але частіше використовують рестрикційні ендонуклеази або рестриктази.
Рестрикція
Рестриктази - група ферментів класу гідролаз, що каталізують реакцію гідролізу нуклеїнових кислот. В молекулярній біотехнології знайшли широке використання завдяки властивості гідролізу лише у певних місцях - сайтах рестрикції.
Лігування
Трансформація
Трансформація - метод перенесення чужорідної ДНК в рослинні або бактеріальні клітини. Аналогічна процедура для тваринних клітин називаєтьсятрансфекція. Суть методу полягає в наступному. За допомогою певного механізму чи процедури чужорідна ДНК отримує можливість проникнути крізь клітинну стінку та мембрану, де вона може або вбудуватися в геном клітини-господаря, або ж існувати незалежно (у випадку плазмід).
Скринінг
Оскільки після трансформації утворюються клони, що містять різні продукти лігування, виникає потреба у пошуку і відборі лише тих клонів, що містять досліджувану послідовність. Існує дві загальні стратегії відбору потрібних клонів:[12] 1) пряма селекція; 2) пошук з бібліотек клонів.
При прямій селекції трансформанти висівають на селективне середовище, що містить маркер, який дозволяє рости лише бажаним колоніям. В найпростішому випадку таким маркером є стійкість до антибіотику, який може, наприклад, знаходитись у векторній послідовності. Однак навіть в такому випадку існує можливість трансформації клітин порожньою плазмідою, що не лігувалась зі вставкою. Для точнішого скринінгу використовують додаткові техніки, наприклад використання на агарозному середовищі кольорових маркерів, таких як X-Gal та IPTG.
Інша стратегія полягає в скринінгу через бібліотеки клонів. Бібліотека клонів (клонотека) являє собою колекцію клонів, яка містять в сумі усю генетичну інформацію досліджуваного організмі. Однак якщо для бактерій можливо створити клонотеку, яка міститиме кілька сотень клонів, то для еукаріотичних організмів, чий геном більший за на кілька порядків, підтримувати повну геномну бібліотеку фізично неможливо. В таких випадках створюють бібліотеки кДНК, які містять лише послідовності генів, в яких відсутні інтрони.
Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.
Протокол эксперимента
1. Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарнымиазотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.
2. Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.
3. Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК гибридизуются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.
Анализ скорости отжига (= гибридизации) одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.
