Для выявления протеолитических ферментов у фитопатогенных бактерий применяются белковые среды, не содержащие углеводов, – желатина, казеин и другие белки.
Посев на желатине производится уколом петли с культурой бактерий в середину столбика, не доходя немного до дна пробирки. Пробирки с посевом оставляют при комнатной температуре и просматривают их два-три раза в неделю. Протеолиз определяется по разжижению желатины. Отмечают начало разжижения и его конец, а также образование газа.
Некоторые виды фитопатогенных бактерий с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептон до продуктов глубокого распада – индола, сероводорода, мочевины и аммиака. Для обнаружения этих продуктов производят посев изучаемых бактерий на бульон Готтингера, мясопептонный бульон или пептонную воду и после трехсуточного выдерживания в термостате исследуют образование продуктов распада белка при помощи соответствующих реактивов. Применяемые среды не должны содержать углеводов и, особенно, глюкозы, которая препятствуем образованию индола.
В литературе описаны несколько методов определения индола. Приводим описание некоторых из них.
Определение индола по Сальковскому заключается в том, что 5 мл недельной бульонной культуры бактерий нагревают с 4 мл 10%-ной серной кислоты, а затем прибавляют 0,5–2 мл 0,05%-ного раствора азотнокислого натрия и продолжают нагревание. При наличии индола появляется красно-фиолетовая окраска.
Для определения индола по Эрлиху исследуемую культуру засевают в 5 мл бульона Готтингера или мясопептонного бульона. К суточной культуре приливают 2–3 мл эфира. Смесь тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, затем в течение нескольких минут дают ей отстояться, в результате чего содержащийся в культуре индол экстрагируется эфиром и всплывает кверху. После этого осторожно по стенке пробирки наслаивают пять–восемь капель реактива Эрлиха и в течение 5 мин учитывают результат. Окрашивание эфирного слоя в малиново-розовый цвет свидетельствует о положительной реакции на индол.
Для определения индола по Легаль-Вайлю в пробирку с культурой прибавляют четыре-пять капель 5%-ного раствора нитропруссидного натрия, встряхивают и добавляют несколько капель 40%-ного раствора едкого натрия, а затем вносят несколько капель ледяной уксусной кислоты. При наличии индола происходит сине-зеленая окраска.
По способу Моррели полоски фильтровальной бумаги пропитывают горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты, подсушивают их и подвешивают в засеянную пробирку таким образом, чтобы бумажка не прикасалась к среде. При наличии индола через один–три дня нижняя часть бумажки окрашивается в темно-розовый цвет.
Для определения сероводорода также существует несколько методов.
1. Петлю исследуемой культуры бактерий засевают в пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Готтингера, затем опускают в эту пробирку фильтровальную бумажку, пропитанную насыщенным раствором уксуснокислого свинца, закрепляя ее пробкой. Если бактерии выделяют сероводород, то индикаторная бумага приобретает черно-бурую окраску. Индикаторная бумага на сероводород готовится таким образом: полоски фильтровальной бумаги шириной 5 мм смачивают в растворе, содержащем дистиллированной воды 100 мл, уксуснокислого свинца 20 г и двууглекислой соды 1 г. Бумагу высушивают в термостате в больших стерильных чашках и затем нарезают полосками длиной 5–6 см. Бумажки можно замачивать также и в насыщенном растворе уксуснокислого свинца.
2. Для определения сероводорода по Моррису производят укол в пробирку с питательным агаром, содержащим 0,1% уксуснокислого свинца. Укол лучше всего сделать между агаром и стенкой пробирки, чтобы яснее было видно почернение посевной линии.
