Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:
- взятие материала и его фиксация,
- уплотнение материала,
- приготовление срезов,
- окрашивание или контрастирование срезов.
Для световой микроскопии необходим еще один этап — заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды.
Фиксация обеспечивает предотвращение процессов разложения, что способствует сохранению целостности структур. Это достигается тем, что взятый из органа маленький образец либо погружают в фиксатор (спирт, формалин, растворы солей тяжелых металлов, осмиевая кислота, специальные фиксирующие смеси), либо подвергают термической обработке (для приготовления более толстых срезов (20 - 50 мкм)). Под действием фиксатора в тканях и органах происходят сложные физико-химические изменения. Наиболее существенным из них является процесс необратимой коагуляции белков, вследствие которого жизнедеятельность прекращается, а структуры становятся мертвыми, фиксированными. Фиксация приводит к уплотнению и уменьшению объема кусочков, а также к улучшению последующей окраски клеток и тканей. Объектом исслед-я служат также мазки, отпечатки или тонкие пленки тканей.
Уплотнение материала, необходимое для приготовления срезов, производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте.
Приготовление срезов происходит на специальных приборах — микротомах (для световой микроскопии) и ультрамикротомах (для электронной микроскопии).
Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или напыление их солями металлов (в электронной микроскопии) применяют для увеличения контрастности изображения отдельных структур при рассматривании их в микроскопе.
Гистологические красители (по химической природе) подразделяют на кислые, основные и специальные. Кислые красители - красящие кислоты или их соли (например, пикриновая кислота, эозин, флоксин, азокармин и др.). Структуры, окрашенные кислыми красителями, называют оксифильными или ацидофильными. У основных красителей (сафронин, пиронин, тионин и др.) окрашивающая способность определяется щелочной группой. Элементы ткани, окрашивающиеся основными красителями, определяют как базофильные. Например, цитоплазма клеток чаще всего окрашивается оксифильно, а ядра клеток – окрашиваются базофильно.
Специальные красители специфически взаимодействуют лишь с определенными в-вами. Например, судан III и осмиевая кислота выявляют жиры и жироподобные в-ва.
Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах. Для длительного сохранения обезвоженный гистологический срез заключают между предметным и покровным стеклами в канадский бальзам или другие вещества. Готовый гистологический препарат может быть использован для изучения под микроскопом в течение многих лет.
Для электронной микроскопии срезы, полученные на ультрамикротоме, помещают на специальные сетки, контрастируют солями урана, свинца и других металлов, после чего просматривают в микроскопе и фотографируют. Полученные микрофотографии служат объектом изучения наряду с гистологическими препаратами.
