1)Иммунофлюоресцентные методы
Прямой метод иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, который находится на клетке, в клетке или в тканях. В качестве флюорохрома используют флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ). Он
137
дает зеленое свечение в ультрафиолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат – оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с антителами, мечеными ФИТЦ, инкубируют, отмывают и, при положительном результате, учитывают свечение в люминесцентном микроскопеНепрямой метод иммунофлюоресценции заключается в том, что первоначально антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, которую получают путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном. Для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют меченую флюорохромом антисыворотку против иммуноглобулинов кролика. Такую сыворотку получают путем иммунизации барана иммуноглобулинами кролика. Непрямой метод дает возможность обнаруживать различные
комплексы антиген-антитело с помощью одной меченой антиглобулиновой сыворотки.
Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации бактерий, риккетсий, вирусов, а также для определения рецепторов и антигенов клеток человека и животных.
2)КАМПИЛОБАКТЕРИИ
Кампилобактериоз — острое инфекционное зоонозное заболевание,
характеризующееся синдромом общей интоксикации, преимущественным
поражением желудочно-кишечного тракта и возможностью генерализации
патологического процесса.
Таксономия
Царство Procaryotae, отдел Gracilicutes, семейство Spirillaceae.
Род Campylobacter.
Виды: C.jejuni, C.lari, C.coli, С. fetus
Род Helicobacter, вид: H.pylori
С. jejuni, С. coli, С. lari — термофилы (температурный оптимум 42 °С).
С. fetus — мезофил (температурный оптимум 37 °С).
Морфология
Тонкие, изогнутые в форме запятой (вибриона) или S-образные палочки
длиной 0,5?5,0 мкм, диаметр 0,2?0,8 мкм. Могут напоминать крылья чайки
при соединении двух клеток в короткую цепочку. Грамотрицательны.
Спор и капсул не образуют. Имеют один или два полярно расположенных
жгутика, обеспечивающих им высокую подвижность со стремительным,
«штопорообразным» поступательным характером движения. Подвижность
видна при темнопольной или фазовоконтрастной микроскопии.
Биологические и культуральные свойства
Хемоорганотрофы. Термофилы, способны к росту при 37?44 °С, но не при
25 °С. Микроаэрофилы и капнофилы, т.е. требуют для культивирования
пониженного содержания кислорода и повышенного — углекислого газа.
Оптимальная атмосфера для культивирования патогенных видов
кампилобактерии имеет следующий состав: О2 — 5%, СО2 — 10%, азот —
85%. Энергию кампилобактерии получают из аминокислот и
трикарбоновых кислот, но не из углеводов, к окислению и ферментации
которых не способны.
Кампилобактерий оксидазоположительны, каталазоположительны. Не
гидролизуют желатин и мочевину.
Для культивирования кампилобактерий используют коммерческие
питательные среды на основе железо-эритритного агара. В среды
добавлены вещества, снижающие окислительно-восстановительный
потенциал, и антибиотики.
Антигены
Кампилобактерии имеют общие антигены с возбудителями бруцеллеза и
иерсиниоза.
Кампилобактерии имеют энтеротоксин (вызывает диарею) и цитотоксин,
повреждающий слизистую оболочку толстой кишки.
Эпидемиология
Зооноз. Основным резервуаром кампилобактерий и источником инфекции
для человека служат животные и птицы, преимущественно домашние и
сельскохозяйственные (кролики, свиньи, коровы, козы, овцы, утки, могут
быть собаки и кошки).
Передача кампилобактерий от человека к человеку происходит редко, в
случаях заражения детей раннего возраста от взрослых.
Механизм передачи фекально-оральный, путь — пищевой.
Заражение происходит при употреблении в пищу инфицированных мясных
и молочных продуктов без достаточной термической обработки, а также
овощей и фруктов. Возможен водный путь передачи инфекции.
Географическое распространение кампилобактериоза очень широко, он
встречается на всех континентах, что связано с интенсификацией
животноводства, возросшей международной торговлей животными,
кормами, продуктами животного происхождения, ростом урбанизации.
Патогенез и клиника
Возбудитель попадает в организм человека через рот с инфицированными
продуктами и водой. В желудочно-кишечном тракте, преимущественно в
тонкой (тощей) кишке и реже в толстой, в месте входных ворот инфекции
возникают воспалительные изменения слизистой оболочки.
При большой инфицирующей дозе и сниженной резистентности
макроорганизма развивается бактериемия с диссеминацией возбудителя в
различные органы и ткани.
Кампилобактериоз протекает в основном в виде энтеритов и
энтероколитов, Возможны заболевания внекишечной локализации:
септицемия, эндокардит, перикардит, менингит.
Методы лабораторной диагностики
Лабораторная диагностика включает бактериологический и
серологический методы исследований.
Бактериологический метод. Материалом для исследования — фекалии,
кровь, мокрота, гной, спинномозговая жидкость, объекты внешней среды
(пищевые продукты, вода).
Материал засевают на одну из селективных питательных сред, посевы
выращивают 72 ч при 37?42 °С в смеси 85 % азота, 10% углекислого газа и
5 % кислорода.
На жидких питательных средах кампилобактер через 48?72 ч инкубации
образует равномерное помутнение с выраженным осадком, на полужидких
растет в виде дисков, расположенных на глубине 1?2 мм от поверхности
питательной среды. На селективных плотных питательных средах
обнаруживаются два типа колоний. Колонии первого типа
негемолитические, сероватые, плоские, блестящие, прозрачные, влажные,
как бы растекающиеся, похожие на капли водяных паров. Колонии второго
типа также негемолитические, более плотные и оформленные, чем
колонии первого типа, выпуклые.
Из подозрительных на кампилобактерии колоний готовят мазки,
окрашивают по Граму. Обнаружение при микроскопировании мазков
грамотрицательных изогнутых или спиралевидных палочек является
основанием для пересева на кровяной агар с антибиотиками с целью
выделения чистой культуры.
Родовая принадлежность выделенной чистой культуры кампилобактера
определяется по результатам изучения морфологических свойств, на
основании положительных результатов тестов на способность к продукции
цитохромоксидазы и каталазы. Видовая принадлежность — по результатам
тестов на способность к быстрому гидролизу гиппурата натрия и
резистентности к налидиксовой кислоте.
Серологический метод исследования играет важную роль при
эпидемиологических исследованиях. Используют РИФ,
иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноэлектрофорез, реакцию
агглютинации (РА), непрямой гемагглютинации (РНГА),
микроагглютинации, латекс-агглютинации.
Лечение
Антибиотикотерапия. Наиболее эффективными средствами этиотропной
терапии являются эритромицин и гентамицин.
Профилактика только неспецифическая.
Helicobacter pylori расценивается как возбудитель язвенной болезни
желудка и двенадцатиперстной кишки. Н. pylori несколько крупнее других
видов кампилобактерий. H. pylori — лофотрих или монотрих. Для роста
требуются микроаэрофильные условия или атмосфера, обогащенная СО2.
В аэробных или анаэробных условиях не растет.
Растет на средах для кампилобактерий, но предпочтение отдает
«шоколадному» агару, образуя на нем колонии диаметром 0,5?1,0 мм. На
10%-ном кровяном агаре отмечается слабый гемолиз.
H. pylori оксидазо- и каталазопозитивен; сероводород не образует, имеет
уреазу.
Факторами вирулентности H. pylori служат: подвижность; уреаза
(нейтрализует HCl и повреждает эпителиоциты); протеиновый цитотоксин,
вызывающий вакуолизацию эпителиальных клеток и повреждающий
межклеточные мостики; липополисахарид; протеиназа; липаза; каталаза.
3)Вакцины (от лат. vacca – корова) – препараты из возбудителей заболевания или их протективные антигены, предназначенные для создания активного специфического иммунитета с целью профилактики и лечения инфекций.
По способу получения вакцины классифицируются на живые, убитые, химические, искусственные, генно-инженерные и анатоксины.
Живые, аттенуированные (ослабленные) вакцины получают путем снижения вирулентности микроорганизмов при культивировании их в неблагоприятных условиях или при пассировании на маловосприимчивых животных.
К живым вакцинам относятся вакцины против бешенства, туберкулеза, чумы, туляремии, сибирской язвы, гриппа, полиомиелита, кори и др. Живые вакцины создают напряженный иммунитет, сходный с естественным постинфекционным. Как правило, живые вакцины вводят однократно, т.к. вакцинный штамм персистирует в организме.
Новое направление – получение вакцинных мутантных штаммов, живущих короткое время, но создающих иммунитет. У людей с иммунодефицитами даже ослабленные бактерии или вирусы живых вакцин могут вызывать тяжелые инфекционные осложнения.
Убитые вакцины готовят из штаммов микроорганизмов с высокой иммуногенностью, которые инактивируют нагреванием, ультрафиолетовым облучением или химическими веществами. К таким вакцинам относятся вакцины против коклюша, лептоспироза, клещевого энцефалита и др. Нередко используют не целые клетки, а их экстракты или фракции.
Аттенуированные и убитые вакцины содержат много различных антигенных детерминант, из которых протективными, т.е. способными индуцировать иммунитет, являются немногие. Поэтому выделение из микроорганизмов протективных антигенов позволило получить химические вакцины. Примером такой вакцины является химическая холерная вакцина, которая состоит из анатоксина-холерогена и липополисахарида, извлечённого из клеточной стенки холерного вибриона. Аналогами бактериальных химических вакцинявляются вирусные субъединичные вакцины, состоящие из гемагглютинина и нейраминидазы, выделенных из вируса гриппа (гриппол). Химические субъединичные вакцины менее реактогенны. Для повышения иммуногенности к ним прибавляют усилители иммунного ответа, создающие депо АГ – адьюванты (гидроксид алюминия, алюминиево-калиевые квасцы и др.), а также иммуномодуляторы, например полиоксидоний в вакцине гриппол.
Анатоксины получают путем обработки экзотоксинов 0,3% раствором формалина. При этом токсин утрачивает свои токсические свойства, но сохраняет антигенную структуру и иммуногенность, т. е. способность вызывать образование антитоксических антител. Условия инактивации и перехода в анатоксин у разных токсинов отличаются: для дифтерийного токсина это обработка 0,4% формалином при 39-40?С в течение 30 дней; для стафилококкового – 0,3-0,4% формалином при 37?С в течение 30 дней; для ботулинического – 0,6-0,8% формалином при 36?С 16-40 дней. Анатоксины используют для создания антитоксического иммунитета при дифтерии, столбняке и других инфекциях, возбудители которых продуцируют экзотоксины.
При создании генно-инженерных вакцин применяют перенос генов, контролирующих нужные антигенные детерминанты, в геном других микроорганизмов, которые начинают синтезировать соответствующие антигены. Примером таких вакцин может служить вакцина против вирусного гепатита В, содержащая НВs-антиген. Её получают при встраивании гена, контролирующего образование НВs-антигена, в геном клеток эукариот (например, дрожжей).
Растительные вакцины: в геном растений встраивают гены микробов, образующие нужные антигены.
ДНК-вакцины представляют собой нуклеиновую кислоту патогена, которая при введении в организм вызывает синтез белков и иммунный ответ на них. Так, например, ДНК-вакцина на основе гена NP, кодирующего нуклеопротеин вируса гриппа, введенная мышам, защищала их от заражения этим вирусом.
Новые вакцины – дендритные клетки, несущие иммунизирующий антиген (ДК-АГ), являются сильными стимуляторами иммунитета, оптимальными антигенпредставляющими клетками. ДК выделяют из крови в культуре клеток и различными способами делают их антигеннесущими: путем сорбции или антигенами, или их инфицирования, или введением в них ДНК или РНК, синтезирующих
Требования к вакцинам весьма строгие. Они должны быть:
а) высокоиммуногенными и создавать достаточно стойкий иммунитет;
б) безвредными и не вызывать побочных реакций;
в) не содержать посторонних микроорганизмов.
