Колоніальна політика Польщі, посилення кріпацтва, покатоличення викликали активний протест українського населення і зумовили шерег потужних повстань, які мали антифеодальний та національно-визвольний характер.
На кінець XVI ст. активізувалися походи козаків проти Туреччини, що помітно погіршило її стосунки з Польщею. У відповідь польський уряд категорично заборонив походи і стратив деяких їхніх організаторів. Але це не зупинило козаків. Поступово їхні виступи проти польських панів набувають дедалі більш організованих форм. У 1591 р. починається повстання реєстрових козаків під орудою К. Косинського. Приводом прислужилася, як це часто бувало, особиста образа Косинського на князя Острозького, який відібрав у нього маєток. Проте незабаром повстання, підтримане місцевими селянами, охопило Київщину, Брацлавщину, Поділля і Волинь.
У лютому 1593 р. князь Острозький розбиває військо Косинського на р. П'ятці. Козаки укладають угоду, згідно з якою Косинський позбавляється гетьманства, козаки втрачають право нападати на сусідні країни, а селяни-втікачі повертаються до своїх поміщиків. Але Косинський з вірними козаками тікає на Січ і звідти у травні 1593 р. наступає на Черкаси. Там він зазнає поразки від черкаського і канівського старости Є. Вишневецького та гине. Його військо відступає на Запоріжжя.
В 1594- 1596 рр. розгортається нове повстання під проводом С. Наливайка, який, до речі, був сотником у князя Острозького і брав участь у придушенні повстання Косинського. Але після битви на р. П'ятці він кидає службу і організовує загін нереєстрових козаків для походів на татар. Захопивши багато здобичі, Наливайко посилає гінців на Січ із закликом розгорнути антипольську боротьбу. Запорізькі козаки, очолювані Г. Лободою, виступили на підтримку, і вже до початку І596 р. повстання охопило Київщину, Брацлавщину, Волинь, Поділля. Не останню роль у такому стрімкому успіхові відіграло те, що основні польські сили у цей час перебували у Молдавії, де підтримували польського ставленика на молдавський трон. Але, побачивши реальну загрозу з боку козаків, польський уряд вирішує направити проти них коронне військо.
У березні 1596 р. повстанці С. Наливайка об'єднуються з загонами Г. Лободи та полковника М. Шаули і в урочищі Гострий Камінь біля Трипілля дають бій полякам, після якого, забравши свої сім'ї, мусять відступати за Дніпро і рухатись на схід. Біля м. Лубни в урочищі Солониця вони стали табором, очікуючи допомоги запорожців, але були оточені. Складне становище козаків погіршувалося загостренням суперечностей серед старшини. Лободу вбивають за підозрою в зраді, а Наливайка і Шаулу видають полякам. Опір було зламано. Наливайка і його соратників повезли до Варшави і у квітні 1597 р. стратили.
Селянсько-козацькі повстання кінця XVI ст. зазнали поразки через внутрішню неорганізованість і відсутність єдності. Але вони ж наочно продемонстрували вплив нового соціального явища - козацтва, особливо у спілці з селянством, дрібною шляхтою та міщанами.
Інший шлях реалізації потенціалу козацтва обрав видатний діяч вітчизняної історії - гетьман П. Сагайдачний. Народився він на Самбірщині, освіту здобув в Острозькій школі та в школі Львівського братства. Уславився як видатний організатор козацьких походів проти татар і турків.
Спершу П. Сагайдачний проводив політику мирних угод і компромісів для захисту прав України. Він зі своїми козаками брав участь у війні польського короля Сигізмунда III з Росією. Але найвизначнішу роль Військо Запорізьке відіграло під час Хотинської війни.
У 1620 р. Туреччина організувала 150-тисячний похід з метою остаточно розбити Польську державу. Польща змогла виставити лише 40-тисячне військо і тому змушена була звернутися по допомогу до козаків, пообіцявши їм поступки у релігійному питанні та значну платню. Але вирішальним тут було інше: Сагайдачний чітко усвідомлював, що агресія Туреччини не обмежиться Річчю Посполитою, а продовжиться вже проти України. В Хотинській битві брало участь 40-тисячне козацьке військо, що стало важливим фактором перемоги поляків (жовтень 1621 р.). Але за умовами Хотинського миру козакам було заборонено плавати Дніпром у Чорне море і здійснювати походи до турецьких берегів. Кордон між Туреччиною і Польщею встановлювався по Дніпру.
У 1625 р. після повстання на чолі з М. Жмайлом польський уряд змушений був підписати Куруківську угоду, згідно з якою козацький реєстр становив уже 6 тис. у складі шести полків - Київського, Корсунського, Канівського, Черкаського, Білоцерківського, Переяславського, але козакам було заборонено здійснювати самостійні військові походи.
Приводом для наступного заворушення стали суперечності між реєстровими і нереєстровими козаками. В 1630 р. запорожці під орудою Т. Федоровича (Трясила) виступили з Січі. Незабаром повстання охопило Лівобережжя і частину Правобережжя. 30-тисячний загін повсталих розгромив коронне військо під Переяславом і змусив Річ Посполиту шукати компромісу. Нова угода збільшувала реєстр до 8 тис. осіб, зберігалися привілеї козацької старшини. І хоча Федорович з частиною козаків повернувся на Запоріжжя, селяни, міщани та нереєстрові козаки ще якийсь час продовжували боротьбу. Широкий суспільний рух в Україні змусив королевича Владислава у 1633 р. затвердити на сеймі «Статті для заспокоєння руського народу», які легалізували існування православної церкви і повертали їй частину майна. Але вже у 1634 р., після закінчення польсько-російської війни, в якій на боці Польщі воювали й козаки, уряд Речі Посполитої знову урізає права та вольності українців. Щоб нейтралізувати Січ, польський уряд будує у 1635 р. на Дніпрі фортецю Кодак, але того ж року козаки під командуванням І. Сулими розгромили кодацьку залогу та зруйнували фортецю.
У 1637-1638 рр. вибухнули нові повстання під керівництвом П. Бута (Павлюка), Д. Гуні та Я. Острянина. Тут знову показала себе проблема суперечностей між реєстровим і нереєстровим козацтвом, що й стало однією з причин поразки у 1638 р. Це дало можливість Польщі в тому ж році нав'язати козацтву «Ординацію Війська Запорізького реєстрового, яке перебуває на службі Речі Посполитої». В ній реєстр обмежувався до 6 тис., на чолі козаків затверджувався польський комісар, заборонялася виборність, відновлювалася фортеця Кодак.
