Активність ферментів визначається їхньою тривимірною структурою. В ранніх дослідженнях було отримано багато доказів того, що ферменти – це білки. Нездатність проходити крізь напівпроникну мембрану, особливості їх розчинності, денатурація при нагріванні і в сильному лужному чи кислотному середовищі – всі ці властивості ферментів співпадають зі звичайними характеристиками білків. В наш час багато ферментів отримано в чистому вигляді та проаналізовано їх будову. У всіх випадках доведено, що вони являють собою білки. Як і всі білки, ферменти синтезуються у вигляді лінійного ланцюжка амінокислот, який згортається певним чином. Кожна послідовність амінокислот згортається особливим чином, і молекула (білкова глобула), що виходить, володіє унікальними властивостями. Кілька білкових ланцюжків можуть об'єднуватися у білковий комплекс. Найбільші рівні структури білків — третинна та четвертинна структури — руйнуються при нагріванні або під дією деяких хімічних речовин.
Щоб каталізувати реакцію, фермент повинен зв'язатися з одним або кількома субстратами. Білковий ланцюжок ферменту згортається таким чином, що на поверхні глобули утворюється щілина або западина, до якої приєднуються молукули субстрату. Ця область називається ділянкою (сайтом) зв'язування субстрата. Зазвичай вона співпадає з активним центром ферменту або знаходиться поблизу від нього. Деякі ферменти містять також ділянки зв'язування кофакторів або іонів металів.
У деяких ферментів присутні також ділянки зв'язування малих молекул, що не беруть безпосередньої участі в реакції і часто, але не обов'язково, є субстратами або продуктами метаболічного шляху, в який входить фермент. Вони зменшують або збільшують активність ферменту, що створює можливість для зворотного зв'язку або регуляції роботи ферменту.Для активних центрів деяких ферментів характерне явище кооперативності.
