Харківський університет відіграв помітну роль в українському національному відродженні у XIX — на початку XX ст. До відкриття Київського університету 1834 року він був провідним центром українського національного життя в Наддніпрянщині. У другій половині XIX ст. Харківське історико-філологічне товариство запровадило широкі дослідження з історії та побуту Слобідської та Лівобережної України. Студенти об'єднувалися в українські громади, у яких брали участь, зокрема, Олександр Потебня, Василь Мова-Лиманський та ін.
1906 року університет присвоїв звання почесного доктора лідерам українського національного руху Михайлові Грушевському та Іванові Франку, а 1910 року — авторці «Истории украинского народа» Олександрі Єфименко. 1907 р. Микола Сумцов, Дмитро Багалій та Михайло Халанський почали читати в університеті лекції з народної словесності, історії України й мовознавства українською мовою.
Університет стояв біля витоків усієї вищої освіти Харківщини. З нього виокремилися Національна юридична академія. Національна фармацевтична академія. Харківський медичний університет. Харківський педагогічний університет. Харківська зооветеринарна академія. Харківська академія культури. Харківський економічний університет та інші вищі навчальні заклади.
Харків вважали центром національного відродження, і утримував він цей почесний титул до утворення в Києві університету Святого Володимира.
