Академія була заснована Констянтином Острозьким. Вона була першою на території України греко-слов*янською школою. Першим ректором був Герасим Смотрицький, серед викладачів були високоосвічені й відомі особистості того часу. В школу приїздили вчитися з Галичини та Литви. У стінах Острозької академії навчався і гетьман Петро Сагайдачний Конашевич. В Острозькій академії викладалися різні мови: слов*янську, грецьку, латинську, також граматику, арифметику, логіку, риторику.
Заснування Острозької слов'яно-греко-латинської академії більшість сучасних авторів відносять до 1576 р. Саме в цей час князь Василь-Костянтин Острозький остаточно закріпив за собою право власності на це місто своїх предків. А вже в 1578 р. в першості Острожського друкарства — «Буквар» Івана Федорова, ми зустрічаємо перші письмові згадки про діяльність в Острозі навчального закладу, для молодших учнів для якого ця книга, власне, призначалася. 1579 р. датується заповіт Гальшки Острозької, де відкритий князем освітній центр, вперше названий академією.
1582 р. князь здійснив великий земельний фонд на збудований ним у Острозі Троїцький монастир і відкритий при ньому шпиталь. Саме через цей релігійний та благодійний заклад, ймовірно, надавалося утримання новоствореної академії й її викладачам. Відомі інші свідоцтва про пожертвування князя В.К. Острозького на ці цілі.
Традиційне для Європи вивчення семи вільних наук ( граматика, риторика, діалекти, арифметики, геометрії, музики, астрономії) вперше в українській освіті було покладено в основу навчальної діяльності Острозької академії в поєднанні з досконалим володінням трьома мовами - грецькрю, латинсько, та церковнослов*янською.
