Билет 5

Вопрос 1 Белки. Классификация белков. Уровни структурной организации белка. Химические связи, ответственные за формирование структуры белка. Биомедицинское значение полипептидов.

 

БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Пептиды имеют очень большое биомедицинское значение; особенно велика их роль в эндокринологии. Пептидами являются многие важнейшие гормоны человека. Их часто назначают больным для коррекции соответствующей недостаточности. Самый известный пример — введение инсулина больным сахарным диабетом. Пептидами являются также различные антибиотики (валиномицин, грамицидин А) и некоторые противоопухолевые препараты (например, блеомицин). Разработанные в последние годы методы быстрогохимического синтеза пептидов позволили наладить производство пептидных гормонов в значительных количествах; это разрешило многие проблемы, поскольку обычно гормоны присутствуют в организме животных в очень малых концентрациях и их трудно выделить в количествах, достаточных для терапевтических целей. По той же технологии осуществляется синтез и других пептидов, которые ввиду их малого содержания тоже трудно выделять из природных источников; в частности, это относится к вирусным пептидам, используемым в качестве вакцин.

Гемсодержащие белки участвуют в процессах связывания и транспорта кислорода, в транспорте электронов в фотосинтезе. Детальное изучение гемоглобина выявляет ряд структурных аспектов, общих для многих белков. Говоря о большом биомедицинском значении этих белков, мы имеем в виду, что результаты, полученные при исследовании, наглядно иллюстрируют структурно-функциональные взаимосвязи. Кроме того, эти исследования выявляют молекулярную основу ряда генетических болезней, таких как серповидноклеточная анемия (возникающая в результате изменения свойств поверхности b-субъединицы гемоглобина) или талассемия (хроническое наследуемое гемолитическое заболевание, характеризующееся нарушениями процессов синтеза гемоглобина). Летальный эффект цианида и окиси углерода объясняется тем, что эти вещества блокируют физиологическую функцию гемопротеинов - цитохромоксидазы и гемоглобина соответственно. Наконец, стабилизация четвертичной структуры дезоксигемоглобина 2,3-бифосфоглицератом (ДФГ) занимает центральное место в исследовании механизмов кислородной недостаточности в условиях высокогорья и процессов адаптации к этим условиям. [1]

ХИМИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ

Химически гемоглобин относится к группе хромопротеидов. Его простетическая группа представляет собой ферросоединение протопорфирина IХ, с молекулярным составом С34Н32О4N4Fe и носит название гем (рис.1). Она придает соединению окраску. Белковый компонент гемоглобина называется глобином. Гемоглобиновая молекула содержит 4 гема и 1 глобин. Аминокислоты расположены в глобине в виде четырех полипептидных цепочек; две из них идентичны по структуре, и их обозначают как альфа-цепочки; две другие тоже идентичны между собой и их обозначают как бета-цепочки. Следовательно, формулу глобина можно выразить как альфа-альфа/бета-бета или альфа2бета2. альфа-полипептидная цепь состоит из 141, бета-полипептидная цепь - из 146 аминокислот.

Аминокислотный состав и последовательность (секвенция) альфа- и бета-цепей показаны на рис. 93. альфа-полипептидная цепь заканчивается комбинацией аминокислот валина-лейцина, а бета-полипептидная цепь - комбинацией валина-гистидина-лейцина. альфа- и бета-полипептидные цепи в гемоглобиновой молекуле не расположены линейно, как это выглядит на первый взгляд из данных ("первичная структура") на рис. 2. По причине существования интрамолекулярных сил, полипептидные цепи скручиваются в форме типичной для белков альфа-геликсовой спирали ("вторичная структура"). Сама альфа-геликсовая спираль на каждую альфа- и бета-полипептидную цепь огибается

пространственно, образуя сплетения овоидной формы ("третичная структура"). На рис. 2 показано "третичное сгибание" полипептидных геликсовых спиралей в пространстве. Отдельные части альфа-геликсовых спиралей полипептидных цепей отмечают латинскими буквами от А до Н (рис. 2 и рис. 3)

Все четыре третично изогнутые альфа- и бета-полипептидные цепи располагаются пространственно в определенном соотношении ("кватернерная структура"), что показано схематически на рис. 4. Они связаны между собой не настоящими химическими связями, а межмолекулярными силами.

Четыре гема гемоглобиновой молекулы расположены в форме дисков меду складками четырех альфа-, соответственно бета-полипептидных цепей (рис. 3), причем каждый гем связан с одной полипептидной цепью посредством координационной связи между Fe++-атомом гема и гистидиновым остатком полипептидной цепи (рис. 5).

Комплекс, составленный из одного гема и одной альфа-, респ. бета-полипептидной цепи, называется Сведберговой единицей. Очевидно гемоглобиновая молекула состоит из четырех Сведберговых единиц. В настоящее время принято считать, что молекулярный вес гемоглобина равен 64458, т.е. на один атом железа, соответственно приблизительно на Сведбергову единицу полагается по 16115.

 

Вопрос 2  Цикл трикарбоновых кислот

Цикл трикарбоновых кислот впервые был открыт английским биохимиком Кребсом. Он первым постулировал значение данного цикла для полного сгорания пирувата, главным источником которого является гликолитическое превращение углеводов. В дальнейшем было показано, что цикл трикарбоновых кислот является "фокусом", в котором сходятся практически все метаболические пути.

 

Итак, образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пирувата ацетил-КоА вступает в цикл Кребса. Данный цикл состоит из восьми последовательных реакций (рис. 91). Начинается цикл с конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом и образования лимонной кислоты. (Как будет видно ниже, в цикле окислению подвергается собственно не ацетил-КоА, а более сложное соединение - лимонная кислота (трикарбоновая кислота).)

Затем лимонная кислота (шестиуглеродное соединение) путем ряда дегидрирований (отнятие водорода) и дскарбоксилирований (отщепление СО₂) теряет два углеродных атома и снова в цикле Кребса появляется оксалоацетат (четырехуглеродное соединение), т. е. в результате полного оборота цикла молекула ацетил-КоА сгорает до СО₂и Н₂О, а молекула оксалоацетата регенерируется. Ниже приводятся все восемь последовательных реакций (этапов) цикла Кребса.

В первой реакции, катализируемой ферментом цитратсинтазой, ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом. В результате образуется лимонная кислота:

По-видимому, в данной реакции в качестве промежуточного продукта образуется связанный с ферментом цитрил-КоА. Затем последний самопроизвольно и необратимо гидролизуется с образованием цитрата и HS-KoA.

Во второй реакции цикла образовавшаяся лимонная кислота подвергается дегидратированию с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту. Катализирует эти обратимые реакции гидратации-дегидратации фермент аконитат-гидратаза:

В третьей реакции, которая, по-видимому, лимитирует скорость цикла Кребса, изолимонная кислота дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы:

(В тканях существует два типа изоцитратдегидрогеназ: НАД- и НАДФ-зависимые. Установлено, что роль основного катализатора окисления изолимонной кислоты в цикле Кребса выполняет НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа.)

В ходе изоцитратдегидрогеназной реакции изолимонная кислота декарбоксилируется. НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg²⁺ или Мn²⁺.

В четвертой реакции происходит окислительное декарбоксилирование α-кетоглутаровой кислоты до сукцинил-КоА. Механизм этой реакции сходен с реакцией окислительного декарбоксилирования пирувата до ацетил-КоА. α-Кетоглутаратдегидрогеназный комплекс напоминает по своей структуре пируватдегидрогеназный комплекс. Как в одном, так и в другом случае в ходе реакции принимают участие пять коферментов: TДФ, амид липоевой кислоты, HS-KoA, ФАД и НАД. Суммарно данную реакцию можно написать так:

Пятая реакция катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой. В ходе этой реакции сукцинил-КоА при участии ГДФ и неорганического фосфата превращается в янтарную кислоту (сукцинат). Одновременно происходит образование высокоэргической фосфатной связи ГТФ1 за счет высокоэргической тиоэфирной связи сукцинил-КоА:

(Образовавшийся ГТФ отдает затем свою концевую фосфатную группу на АДФ, вследствие чего образуется АТФ. Образование высокоэргического нуклеозидтрифосфата в ходе сукцинил-КоА-синтетазной реакции - пример фосфорилирования на уровне субстрата.)

В шестой реакции сукцинат дегидрируется в фумаровую кислоту. Окисление сукцината катализируется сукцинатдегидрогеназой, в молекуле которой с белком ковалентно связан кофермент ФАД:

В седьмой реакции образовавшаяся фумаровая кислота гидратируется под влиянием фермента фумаратгидратазы. Продуктом данной реакции является яблочная кислота (малат). Следует отметить, что фумаратгидратаза обладает стереоспецифичностью, - в ходе данной реакции образуется L-яблочная кислота:

Наконец, в восьмой реакции цикла трикарбоновых кислот под влиянием митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы происходит окисление L-малата в оксалоацетат:

Как видно, за один оборот цикла, состоящего из восьми ферментативных реакций, происходит полное окисление ("сгорание") одной молекулы ацетил-КоА. Для непрерывной работы цикла необходимо постоянное поступление в систему ацетил-КоА, а коферменты (НАД и ФАД), перешедшие в восстановленное состояние, должны снова и снова окисляться. Это окисление осуществляется в системе переносчиков электронов (или в цепи дыхательных ферментов), локализованной в митохондриях.

Освобождающаяся в результате окисления ацетил-КоА энергия в значительной мере сосредоточивается в макроэргических фосфатных связях АТФ. Из четырех пар атомов водорода три пары переносятся через НАД на систему транспорта электронов; при этом в расчете на каждую пару в системе биологического окисления образуются три молекулы АТФ (в процессе сопряженного окислительного фосфорилирования), а всего, следовательно, девять молекул АТФ. Одна пара атомов попадает в систему транспорта электронов через ФАД, - в результате образуются 2 молекулы АТФ. В ходе реакций цикла Кребса синтезируется также 1 молекула ГТФ, что равносильно 1 молекуле АТФ. Итак, при окислении ацетил-КоА в цикле Кребса образуется 12 молекул АТФ.

 

Если же подсчитать энергетический эффект гликолитического расщепления глюкозы и последующего окисления пирувата до СO₂ и Н₂O, то он окажется значительно большим.

Как уже отмечалось, 1 молекула НАДН₂ (3 молекулы АТФ) образуется при окислительном декарбоксилирова-нии пирувата в ацетил-КоА. Так как при расщеплении одной молекулы глюкозы образуются две молекулы пирувата, то при окислении их до 2 молекул ацетил-КоА и последующих двух оборотов цикла трикарбоновых кислот синтезируется 30 молекул АТФ (следовательно, окисление одной молекулы пирувата до СО₂ и Н₂O дает 15 молекул АТФ).

К этому надо добавить 2 молекулы АТФ, образующиеся при аэробном гликолизе, и 4 молекулы АТФ, синтезирующихся за счет окисления 2 молекул внемитохондриального НАДН₂, которые образуются при окислении 2 молекул глицеральдегид-3-фосфата в дегидрогеназной реакции. Итого получим, что при расщеплении в тканях 1 молекулы глюкозы по уравнению: C₆H₁₂0₆ + 60₂ -> 6СO₂ + 6Н₂O синтезируется 36 молекул АТФ, что способствует накоплению в макроэргических фосфатных связях аденозинтрифосфата 36 X 34,5 ~ 1240 кДж (или, по другим данным, 36 Х 38 ~ 1430 кДж) свободной энергии. Другими словами, из всей освобождающейся при аэробном окислении глюкозы свободной энергии (окодо 2840 кДж) до 50% ее аккумулируется в митохондриях в форме, которая может быть использована для выполнения различных физиологических функций. Несомненно, что в энергетическом отношении полное расщепление глюкозы является более эффективным процессом, чем гликолиз. Необходимо отметить, что образовавшиеся в процессе превращения глицеральдегид-3-фосфата 2 молекулы НАДН₂ в дальнейшем при окислении дают не 6 молекул АТФ, а только 4. Дело в том, что сами молекулы внемитохондриального НАДН₂ не способны проникать через мембрану внутрь митохондрий. Однако отдаваемые ими электроны могут включаться в митохондриальную цепь биологического окисления с помощью так называемого глицерофосфатного челночного механизма (рис. 92). Как видно на рисунке, цитоплазматический НАДН₂ сначала реагирует с цитоплазматическим дигидроксиацетонфосфатом, образуя глицерол-3-фосфат. Реакция катализируется НАД-зависимой цитоплазматической глицерол-3-фосфат-дегидрогеназой:

Дигидрооксиацетонфосфат + НАДН₂ <---> глицерол-3-фосфат + НАД

Образовавшийся глицерол-3-фосфат легко проникает через митохондриальную мембрану. Внутри митохондрии другая (митохондриальная) глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа (флавиновый фермент) снова окисляет глицерол-3-фосфат до дигидроксиацетонфосфата:

Глицерол-З-фосфат + ФАД <---> Дигидроксиацетонфосфат + фАДН₂

Восстановленный флавопротеид (фермент - ФАДН₂) вводит, на уровне KoQ приобретенные им электроны в цепь биологического окисления и сопряженного с ним окислительного фосфорилирования, а дигидроксиацетонфосфат выходит из митохондрий в цитоплазму и может вновь взаимодействовать с цитоплазматическим НАДН₂. Таким образом, пара электронов (из одной молекулы цитоплазматического НАДН₂), вводимая в дыхательную цепь с помощью глицерофосфатного челночного механизма, дает не 3 АТФ, а 2 АТФ.

В настоящее время четко установлено, что глицерофосфатный челночный механизм имеет место в клетках печени. Относительно других тканей этот вопрос пока не выяснен.

Если же не считать энергии, затрачиваемой на проникновение НАДН₂ в митохондрии, то в результате полного окисления 1 молекулы глюкозы может образоваться 38 молекул АТФ.

 

 

Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК ) или цикл лимонной кислоты или цикл Кребса – путь окислительных превращений ди- и трикарбоновых кислот, образующихся в качестве промежуточных продуктов при распаде и синтезе белков, жиров и углеводов.

Цикл трикарбоновых кислот представлен в клетках всех организмов: растений, животных и микроорганизмов.

Этот цикл является основой метаболизма и выполняет две важных функции:

- снабжения организма энергией;

- интеграции всех главных метаболических потоков, как катаболических (биорасщепление), так и анаболических (биосинтез).

Напомню, что реакции аэробного гликолиза локализованы в цитоплазме клетки и приводят к образованию пирувата (ПВК ).

Последующие превращения пирувата протекают в матриксе митохондрий.

В матриксе пируват превращается в ацетил-КоА – макроэргическое соединение. Реакция катализируется ферментом НАД-зависимой пируватдекарбоксилазой:

Восстановленная форма НАДН∙Н⁺, образовавшаяся в результате этой реакции, поступает в дыхательную цепь и генерирует 6 молекул АТФ (в пересчете на 1 молекулу глюкозы).

ЦТК представляет собой последовательность из восьми реакций, протекающих в матриксемитохондрий (Рис. 1):

Рис. 1. Схема цикла трикарбоновых кислот

1) Необратимая реакция конденсации ацетил-КоА со щавелевоуксусной кислотой (оксалоацетатом), катализируемая ферментом цитратсинтетазой, с образованием лимонной кислоты (цитрата ).

2) Обратимая реакция изомеризация лимонной кислоты (цитрата ) в изолимонную кислоту(изоцитрат ), в процессе которой происходит перенос гидроксигруппы к другому атому углерода, катализируется ферментом аконитазой.

Реакция идёт через образование промежуточного продукта 
цис-аканитовой кислоты (цис-аконитата ).

3) Необратимая реакция окислительного декарбоксилирования изолимонной кислоты (изоцитрата): гидроксигруппа изолимонной кислоты окисляется до карбонильной группы с помощью окисленной формы НАД⁺ и одновременно отщепляется карбоксильная группа в 
β-положении с образованием α-кетоглутаровой кислоты (α-кетоглутарата ). Промежуточный продукт этой реакции щавелевоянтарная кислота (оксалосукцинат ).

Это первая реакция цикла, в которой происходит восстановление окисленной формы НАД⁺-кофермента до НАДН∙Н⁺, фермента изоцитратдегидрогеназы.

Восстановленная форма НАДН∙Н поступает в дыхательную цепь, там окисляется до НАД⁺, что приводит к образованию 2 молекул АТФ.

4) Обратимая реакция окислительного декарбоксилирования 
α-кетоглутаровой кислоты до макроэргического соединения сукцинил-КоА. Реакцию катализирует фермент 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс.

5) Реакция является единственной в цикле реакцией субстратного фосфорилирования; катализируется ферментом сукцинил-КоА-синтетазой. В этой реакции сукцинил-КоА при участиигуанодиндифосфата (ГДФ ) и неорганического фосфата (H ₃ PO ₄ ) превращается в янтарную кислоту (сукцинат ).

Одновременно происходит синтез макроэргического соединения ГТФ за счёт макроэргической связи тиоэфирной связи сукцинил-КоА.

6) Реакция дегидрирования янтарной кислоты (сукцината ) с образованием фумаровой кислоты(фумарата ).

Реакция катализируется сложным ферментом сукцинатдегидрогеназой, в молекуле которой кофермент ФАД⁺ ковалентно связан, а белковой частью фермента. Окисленная форма ФАД⁺ в результате реакции восстанавливается до ФАД∙Н₂.

Восстановленная форма ФАД∙Н₂ поступает в дыхательную цепь, там регенерирует до окисленной формы ФАД⁺, что приводит к образованию двух молекул АТФ.

7) Реакция гидратации фумаровой кислоты (фумарата ) до яблочной кислоты (малата ). Реакция катализируется ферментом фумаразой.

8) Реакция дегидрирования яблочной кислоты до щавелеуксусной кислоты (оксалоацетата ). Реакция катализируется ферментом НАД⁺-зависимой-малатдегидрогеназой.

В результате реакции окисленная форма НАД восстанавливается до восстановленной формы НАДН∙Н⁺.

Восстановленная форма НАДН∙Н поступает в дыхательную цепь, там окисляется до НАД⁺, что приводит к образованию 2 молекул АТФ.

Суммарное уравнение ЦТК можно записать следующим образом:

Ацетил-КоА + 3НАД⁺ + ФАД⁺ + ГДФ + H ₃ PO ₄ =

2 CO ₂ + H ₂ O + HS -КоА + 3НАДН∙Н + ФАД∙Н₂ + ГТФ

Как видно из схемы суммарного уравнения ЦТК в этом процессе восстанавливаются:

- три молекулы НАДН∙Н (реакции 3, 4, 8);

- одна молекула ФАД∙Н₂ (реакция 6).

При аэробном окислении из этих молекул в электрон-транспортной цепи в процессе окислительного фосфорилирования образуется при окислении:

- одной молекулы НАДН∙Н – 3 молекулы АТФ;

- одной молекулы ФАД∙Н₂ – 2 молекулы АТФ.

- одна молекула ГТФ образуется в реакции субстратного фосфорилирования (реакция 5 ).

Всё это составит: 9 (3х3) АТФ + 2 АТФ + 1 АТФ (ГТФ ) = 12 АТФ. Следовательно, энергетический баланс окисления ацетил-КоА (2 молекулы пирувата из аэробного гликолиза ) в ЦТК составляет 24 молекулы АТФ.

Полное окисление глюкозы:

8 молекул АТФ гликолиза + 6 молекул АТФ окислительного декарбоксилирование пирувата вцетил-КоА + 24 молекулы АТФ ЦТК = 
38 молекул АТФ на молекулу глюкозы.